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LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN

1. Tratamiento osteogénico-antiosteoclástico con monofluorofosfato-bisfosfonato.
   
   
2. Estudio del mecanismo de acción del monofluorofosfato de sodio y los bisfosfonatos sobre la remodelación ósea en modelos de osteoporosis en la rata.
   
   
3. Rol de la fosfatasa alcalina en el mecanismo de absorción intestinal de calcio.
   
   
4. Relevamiento del contenido de calcio en lácteos de uso masivo. Construción de una base de datos de acceso libre.
   
   
5. Determinación de los niveles de calcio y vitamina D en alimentos de importancia en el crecimiento y la osteoporosis.
   
6. Desarrollo de acciones para mejorar la ingesta de calcio a nivel poblacional a partir del uso de cáscara de huevo.
   
   
7. Evaluación del contenido de flúor en aguas de consumo de la provincia de Santa Fe. Relación con la salud dental y el riesgo de fluorosis.
   
   
8. Relevamiento y monitoreo del contenido de fluoruro en aguas superficiales y profundas de la provincia de Santa Fe.
   
   
9. Evalución del contenido de flúor en tierras de Santa Fe y su relación con la fluorosis y el crecimiento de cultivos.
   
   
10. Medida de la remodelación ósea utilizando fluoruro como trazador del proceso. Desarrollo de una técnica miniinvasiva para medida de la remodelación en ratas.
    
    
11. Efecto del fluoruro sobre el consumo de oxígeno por diferentes órganos en la rata.
    
    
12. Efecto del tratamiento con MFP y NaF sobre el proceso de reparación ósea en ratas.
    
13. Cooperación Internacional - Proyecto conjunto: Evaluation of insulin signal in muscle and liver in diabetic or not rats after chronic exposure to fluoridelaboración.
    

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1. Tratamiento osteogénico-antiosteoclástico con monofluorofosfato-bisfosfonato

Integrantes: Dra. Verónica Di Loreto, Lic. Merecedes Lombarte, Florencia Bues, Hilda S. Moreno, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por CONICET (PIP 2009-2011)

Introducción

Mecanismo de acción bisfosfonatos
Los bisfosfonatos se unen al mineral óseo y pueden inhibir la resorción ósea por diversos mecanismos, actuando sobre el osteoclasto. Las diferentes generaciones de BP tienen efecto diferentes. Pueden producir toxicidad por formar análogos del ATP o inhibir la enzima farnesil pirofosfato sintetasa con la consecuente inhibición de la prenilación de proteínas. De esta manera los bisfosfonatos disminuyen la adherencia del osteoclasto a la matriz ósea y aumentan su apoptosis. La inhibición del proceso resortivo se acompaña de la acción osteoblástica que rellenan los túneles de osteoclacia. De esta manera se observa una aumento de la masa ósea. La matriz ósea es un depósito de factores de crecimiento que se liberan cuando el osteoclasto degrada el hueso en el proceso de remodelación y, estos factores actúan sobre precursores de osteoblastos. La falta de acción de osteoclasto produce un detenimiento de la pérdida ósea como del turnover, impidiendo la remodelación del tejido.
La adherencia de los bisfosfonatos a la hidroxiapatita depende de la presencia de un grupo oxhidrilo en el carbono que liga los dos fosfatos en la molécula del bisfosfonato. El clodronato, tiene Cl y el tiludronato posee H en dicha posición. Estos bisfosfonatos son los que poseen menor capacidad de adherencia a la hidroxiapatita. Los bisfosfonatos con oxhidrilo sustituído en el carbono (zoledronato, risedronato, alendronato, ibandronato, etidronato, olpadronato) tiene mayor afinidad por la hidroxiapatita. La afinidad de los bisfosfonatos por la hidroxiapatita decrece en el siguiente orden: zoledronato, alendronatao, ibandronato, risedronato, etidronato y clodronato [1]. La capacidad antiresortiva de los bisfosfonatos está relacionado intimamente a esta capacidad de unión y a la presencia de nitrógeno en el otro grupo sustituyente del átomo de carbono [2]. Por otro lado los bisfosfonatos con grupo oxhidrilo en dicha posición poseen gran afinidad por el tejido.

Mecanismo de acción del fluoruro
El fluoruro produce inhibición de una fosfatasa ácida del osteoblasto involucrada en la transmisión de señales mediadas por factores de crecimiento y receptores de tirosin kinasa [3]. La acción del fluoruro produciría un aumento de la vida media de los intermediarios fosforilados de las cascadas de señalización mediadas por las kinasas ERK. Hemos demostrado en nuestro laboratorio un aumento de la masa ósea por acción del fluoruro [4], conociendo las dosis y el tiempo necesario para obtener respuestas farmacológicas significativas.

Diferencias farmacocinéticas entre el NaF y el monofluorofosfato de sodio
Hemos demostrado diferencias farmacocinéticas con respecto al proceso de absorción y transporte de la droga en sangre.  El monofluorofosfato de sodio se absorbe en estómago y se liga a la alfa-2-macroglobulina [5], el hueso tiene receptores que depuran al complejo de circulación [6]. La alfa-2-macroglobulina inactivada puede ser depurada fundamentalmente por dos tipos de receptores: LRP (low density liproprotein related protein) y receptor scavenger. Trabajos in vitro indicarían que estos receptores estarían involucrados en el proceso de depuración del complejo. También se demostró in vitro que los péptidos con flúor prevenientes de la proteolisis del complejo son captados por receptores del tejido óseo y hepático.
Trabajos in vivo han demostrado que la administración de monofluorosfato de sodio en dosis equivalentes a NaF produce aumento de masa ósea similar respecto de controles luego de 30 días de tratamiento. El hueso de ratas tratadas con monofluorofosfato de sodio presenta proteínas con flúor ligado. Estas proteínas reaccionan con anticuerpos anti A2M y no se hallan presente en el hueso de ratas tratadas con NaF. La suspensión de ambos tratamientos determina que al cabo de 30 días la masa ósea de los animales tratados con NaF no discrepe de los controles, sin embargo la masa ósea de animales tratados con monofluorofosfato de sodio no decreció siendo significativamente superior que controles y tratados con NaF [7,8]. El proceso fue acompañado por un decrecimiento de las proteínas ligadas con flúor en matriz ósea y aumento de péptidos de menor peso molecular. Las proteínas detectadas con el anticuerpo tuvieron peso molecular comparable al de la A2M (720 kDa) al finalizar los 30 días de tratamiento y al final de los 30 días de suspensión del tratamiento disminuyó esta fracción aumentando las proteínas de menor peso molecular, reactivas al anticuerpo anti A2M, indicando un procesamiento intraóseo. Es probable que durante este tiempo estas proteínas recirculen, posiblemente removidas de la matriz por la acción de osteoclastos. Podrían entonces estos péptidos actuar sobre receptores osteoblásticos de una manera sostenida, sumando su efecto a las concentraciones de flúor generadas por la hidrólisis de los péptidos.

Diferenciación de los osteoblastos
La diferenciación y proliferación de osteoblastos a partir de células pluripotentes del estroma de la médula ósea involucra a las cascadas de señalización del sistema Wnt/beta-catenin. Los osteoblastos poseen expresión del receptor LRP en sus isoformas LRP5y LRP6. La acción de Wnt sobre el osteoblasto requiere la heterodimerización del receptor LRP5/6 y el receptor Frizzled. La dimerización produce señales intracelulares que inhiben a la enzima GSK3 (glycogen sinthase kinase 3) que fosforila a beta-catenina, haciéndola sensible a ubiquitinas ligasas que determinan su posterior degradación por proteosomas. En consecuencia la inhibición de GSK3 produce un estado no fosforilado de beta-catenina que se acumularía y sería traslocada al núcleo donde interactua con coactivadores produciendo la expresión de genes que determinan la diferenciación y proliferación del osteoblasto [9].
La A2M, la A2M unida a monofluorofosfato de sodio y los péptidos generados durante su procesamiento son reconocidos por anticuerpos policlonales anti A2M. El receptor LRP reconoce a la A2M luego de su inactivación, proceso que puede ser llevado a cabo por la unión a proteinasas o a moléculas como el monofluorosfato de sodio. La A2M-Monofluorofosfato de sodio como los péptidos son captados por tejido óseo, indicando que los receptores de estos tejidos la reconocen.
Bien podría atribuirse el efecto del monofluorofosfato de sodio sobre el hueso al fluoruro liberado por su hidrólisis. sin embargo el mecanismo no parece ser igual, ya que al suspender el tratamiento, la masa ósea de los animales se mantiene elevada, respecto de los controles y los animales tratados con NaF, en los que la MO se asemeja a los controles luego de 30 días. Los resultados mencionados sugieren una posible interacción del complejo A2M-monofluorofosfato de sodio con el receptor LRP5/6 de precursores osteoblásticos. Esta interacción podría aumentar la afinidad entre LRP5/6 y el receptor Frizzled o bien disminuir la acción de proteínas inhibidoras del receptor LRP5/6 como son las proteínas DKK y esclerostin.

Objetivo
Evaluar los resultados de la terapia osteoformadora con monofluorofosfato de sodio y antirresortiva con bisfosfonatos.

Materiales y Métodos

Trabajos in situ
Estudios de biodisponibilidad, absortividad y competencia de bisfosfonatos y monofluorofosfato. Coadministración de las drogas.
Se utilizará la técnica de intestino aislado in situ. Los animales bajo anestesia con uretano son sometidos a aislamiento del intestino delgado. Se monitorea la concentración de monofluorofosfato de sodio  y bisfosfonatos en luz intestinal y sangre de los animales. La aplicación de modelos matemáticos permitirá conocer las constantes de velocidad de los procesos involucrados y los órdenes de los mismos.
Para resolver problemas experimentales imprevistos se dispone de las técnicas de saco evertido intestinal y perfusión de intestino.

Trabajos in vivo
Dosis: Se utilizará la dosis de monofluorofosfato de sodio  40 umol/100g.día por sonda gástrica. BP dosis: zoledronato 1.5 ug/kg subcutaneamente una vez a la semana.
1- Experimento exploratorio: Investigación de huesos de mayor respuesta a tratamiento combinado (monofluorofosfato de sodio  + Bisfosfonato). Se tratarán ratas durante 30-100 días con monofluorofosfato de sodio  y BP. Al final de tratamiento se sacrificarán de los animales, se realizará la evisceración, digestión de los tejidos blando con papaína, separación de los huesos y medida de masa ósea por histomorfometría y gravimetría.
2- Evaluación del tratamiento en ratas normales y control de la eficacia de conversión de alimento en biomasa. Con el fin de comprobar que el tratamiento no tenga efectos negativos sobre el crecimiento y estado general, se realizará el tratamiento con monofluorofosfato de sodio + bisfosfonato en ratas normales durante 30-100 días. Los animales serán alojados en jaulas metabólicas individuales y se llevará control del consumo de alimento y variación de peso. Durante el experimento se realizarán medida de marcadores óseos específicos para rata (ver marcadores óseo)
Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento sobre el tejido óseo, al finalizar el período de tratamiento se realizará la medida de variables indicadoras de la masa ósea y de los procesos de formación y resorción ósea: masa ósea por gravimetría, contenido y calidad del mineral por determinaciones del contenido de cenizas, contenido de calcio y fósforo, turnover óseo por histomorfometría.
Evaluación por análisis de la microscopia de fluorescencia y de barrido láser confocal de la co-localización de receptores LRP y A2M en células óseas. Se dispone de un anticuerpo anti A2M de rata elaborado en cobayos por personal de nuestro laboratorio. Se obtendrá anticuerpo anti Ig de cobayo marcado con fluoróforo adecuado para llevar adelante la microscopia confocal. Los anticuerpo anti LRP y el anticuerpo secundario serán obtenidos de proveedores especializados.
La variación de A2M en plasma se evaluará por electroforesis en geles de poliacrilamida al 5%, transferencia a membrana de nitrocelulosa y Western Blot. La concentración de A2M se evaluará por dot blot.
3- Repetición del punto 2 con ratas ovariectomizadas (OVX). La rata ovariectomizada es un reconocido modelo de osteoporosis por aumento de la resorción por sobre la formación, con aumento del turnover óseo.

Trabajos in vitro
Experimento en cultivos celulares primarios de osteoblastos de rata [10]: evaluación del efecto de las proteínas con flúor presentes en el hueso sobre la diferenciación y proliferación de células osteoblásticas en cultivo.
Se obtendrán proteínas del hueso de ratas tratadas con monofluorofosfato de sodio  durante 30 días. Para ello los huesos serán molidos y una alícuota de los mismos será sometido a extracción con EDTA 0.5 M pH 8.5. La solución resultante contiene a las proteínas no colágenas del hueso. Estas proteínas serán sometidas a cromatografía de exclusión molecular de manera de producir un separación por peso molecular. Las diferentes fracciones serán utilizadas para estimular a células en cultivo.
Las fracciones serán analizadas por western Blot para comprobar la presencia de péptidos con secuencias características de la A2M.
Se investigará el efecto sobre la proliferación de osteoblasto por captación de timidina tritiada. El estudio se llevará a cabo en placas de cultivo sobre subconfluentes poblaciones. Las células con crecimiento en arresto serán estimuladas por un periodo de tiempo con las fracciones purificadas de las proteínas ósea con flúor. Luego de este período las células serán sometidas a un pulso de timidina tritiada. La captación del marcador será calculada por medición de la radioactividad en el medio de cultivo

Histomorfometría ósea
Se realiza sobre cortes histológicos de hueso sin desmineralizar, incluido en metilmetacrilato, teñidos con azul de toluidina. Se medirán parámetros estáticos y dinámicos del hueso. Las mediciones se realizan utilizando un programa de análisis de imágenes digitales, sobre microfotografías de cortes histológicos de los huesos.

Índices estáticos
1- Masa ósea o volumen óseo (es el % de área microscópica que es hueso esponjoso, consistente en hueso mineralizado y no mineralizado).  2- Volumen de osteoide: volumen de osteoide sin calcificar comparado con volumen óseo. 3- Superficie de osteoide o % hueso trabecular con osteoide: es el porcentaje de la superficie ósea cubierta por osteoide. 4- Espesor de la capa de osteoide 5- Diámetro trabecular: μm 6- Interfase hueso osteoblasto: % de superficie ósea en contacto con el osteoblasto. 7- Number of osteoblasts per mm2 de superficie ósea 8- Superficie cubierta por osteoblastos = % de hueso trabecular cubierto por osteoblastos 9- Superficie de osteoclastos = % de hueso trabecular cubierto por osteoclastos

Marcadores óseos

Marcadores de resorción ósea específicos para la rata
(CTX-1) en ratas. El ensayo detecta el C-telopeptido del colágeno tipo I generado durante la resorción ósea por osteoclastos. El equipo es apto para la medida en orina, plasma o sobrenadante de cultivos celulares. Recolección de muestras: sangre u orina luego de una noche a ayuno. Almacenamiento de muestras: para prolongados almacenamientos -18° C. Tamaño de muestra para el ensayo: 20 uL. Límite de detección: 2 ng/nL. Método: ELISA competitivo. Analito utilizado: secuencia EKSQDGGR específica para el telopéptido C terminal de la cadena alfa del colágeno tipo I de rata. Está demostrado un aumento del 100% de Rat Laps luego de 2 semanas de OVX.

sRANKL [11]
RANKL es una citoquina que presenta dos isoformas. Una de ellas que se encuentra unida a membrana de células del estroma de la medula ósea del linage osteoblastico. La otra isoforma carece del dominio intracelular que determina la unión a membrana y por lo tanto se encuentra en forma soluble, saliendo a circulación. Esta proteina de la familia del Tumor necrosis factor, se une al receptor RANK (Receptor activador del factor nuclear KB) de células del linage hematopoyético, que darán origen a precursores de osteoclastos. Sus niveles elevados están correlacionados con aumento del estímulo de osteoclastogénesis. Sus valores deben ser analizados en función de los valores de osteoprotegerina (OPG), receptor soluble de RANKL que impide la unión a RANK.

Opciones.
sRANKL EIA. 100% de reactividad cruzadacon rata. Volumen de muestra: 10 uL.Sensibilidad: 0.7 pmol/L
sRANKL Elisa. Especimen: suero. Volumen de muestra: 10 uL. Sensibilidad: 0.7 pmol/L. CV intra ensayo<6%, CV interensayo<10%
Deoxipiridinolina libre (Dpd). La Dpd es un crosslink del colágeno tipo I que se libera durante el proceso de resorción ósea

Opciones
Metra DPD. Method: competition ELISA. Muestra: orina. volumen de muestra: 50 ul (diuted 1:10). Límite detección 1.1 nmol/L. Reactividad interespecie: humano, rata, rabbit, guinea pig.
Pyridium crosslink in urine and serum. Metodo: ELISA competitivo. Muestra: orina. Volumen de muestra: 50 ul (urine diluted 1:10),25 ul serum. Límite de detección 7.5 nmol/L (urine), 0.4 nmol/L (serum). Reactividad interespecies: humanos, rata, conejo, cobayo.
DPpd Total (libre y unida) Dpd en orina y suero. Método: ELISA competitivo. Límite de detección: 0.5 nmol/L. muestra: suero y orina. Volumen de muestra: 100 ul. Reactividad interespecie: humanos, rata, guinea pig
TRACP5 (Fosfatasa ácida tartrato resistente). La TRACP existe en dos formas TRACP5a (de macrófagos y células dendríticas, asociada a procesos inflamatorios) y TRACP5b (de osteoclastos, asociado a procesos osteolíticos). Existen kit específicos para la medida de la TRAPC5b
TRACP5b. No tiene reactividad cruzada con TRAPC5a . Metodo: ELISA. muestra: suero. Volumen de muestra: 25 uL. Rango dinamico: 0.5-9.0 U/L. precision: CV intra ensayo < 6%, CV interensayo < 6%

Marcadores de formación ósea específicos para la rata
Osteocalcin. RAt-MID osteocalcin ELISA
Obtención de muestras: recolectar suero o plasma y medir dentro de las 3 hs. Para almacenamiento prolongado guardar a temperatura < -18°C. volumen de muestra: 20 uL. Límite de detección: 50 ng/mL. Metodo; ELISA competitivo. Esta demostrado un incremento del 50% de Osteocalcin luego de 2 semanas de la OVX.
Osteocalcin. Método: IRMA. sensibilidad: 0.02 ng/mL. Volumen de muestra: 20 uL.
Muestra: serum or plasma
Fosfatasa alcalina ósea específica. metodo competitive Elisa. Muestra: Plasma heparinizado, suero o sobrenadatne de cultivos. Volumen de muestra: 20 uL

Determinación de monofluorofosfato
La determinación de monofluorofosfato de sodio se realizará por una técnica desarrollada en nuestro laboratorio que combina la hidrólisis del monofluorofosfato de sodio  con fosfatasa alcalina en medio alcalino y la lectura potenciométrica del flúor liberado.
Determinación de la concentración de proteínas con flúor: Se desarrollará por potenciometria combinando potenciometría directa y ultrafiltración. Para la determinación de flúor ligado por enlaces ácido resistente se utilizará una técnica que se halla aun en desarrollo en nuestro laboratorio, pero que ya cuenta con utilización en trabajos anteriores.
Determinación de la concentración de bisfosfonatos
Se dispone de cromatógrafo de gases con el que se pondrá a punto una técnica de determinación utilizando derivados adecuados con detector de captura electrónica o espectroscopia de masas. Será investigada la determinación por espectroscopia utilizando la presencia de un grupo imidazol en la estructura del bisfosfonato.

REFERENCIAS
[1] Nancollas GH, Tang R, Phipps RJ, Henneman Z, Gulde S, Wu W, Mangood A, Russell RGG, Ebetino FH. Novel insights into actions of bisphosphonates on bone: differences in interactions with hydroxyapatite. Bone 38: 617-627. 2006.
[2] Leu C-T, Luegmayr Eva, Freedman LP, Rodan GA, Reszka AA. Relative binding affinities of bisphosphonates for human bone and relationship to antiresorptive afficacy. Bone 38: 628-636. 2006.
[3] Lau, K.H; Farley, J.R; Freeman, T.K; Baylink, D.J. A proposed mechanism of the mitogenic action of fluoride on bone cells inhibition of the activity of an osteoblastic acid phosphatase. Metabolism 38: 858-868. 1989.
[4] Rigalli A, Ballina JC, Beinlich A, Alloatti R, Puche RC. Pharmacokinetics differences between sodium fluoride and sodium monofluorphosphate and comparative bone mass increasing activity of both compounds, in the rat. Arzneimittel Forschung. Drug Research. 44(I), 762-766. 1994.
[5] Rigalli A, Esteban L, Pera L, Puche RC. Binding of monofluorophosphate to a2-macroglobulin and C3. Calcified Tissue International 60(I) 86-89. 1997.
[6] Esteban L, Rigalli A, Puche RC. Metabolism of the complex monofluorophosphate-a2-macroglobulin in the rat. Medicina (Buenos Aires) 59:151-156. 1999.
[7] Pera L, Brun LR, Rigalli A, Puche RC. Identification of bone a2-macroglobulin (a2M) related-proteins in rats treated with MFP. Its role in fluoride (F) bioavailability. Biocell 27(2): 234 2003.
[8] Pera L, Brun L, Rigalli A, Puche RC. Caracterización de proteínas con flúor ligado en la matriz ósea de ratas tratadas con monofluorofosfato (MFP). Medicina 62(5): 511. 2002.
[9] Krishnan V, Bryant HU, MacDougald A. Regulation of bone mass by Wnt signaling. J. Clin. Invest. 226 (5) 1202-1209.2006.
[10] Lysophosphatidic acid is an osteoblast mitogen whoseproliferative actions involve G(i) proteins and protein kinase C, but not p42/44 mitogen activated protein kinase. Endocrinology 142:1098-1106. 2001.
[11] Nagant N, Kitaura H, Yoshida N, Nakayama K. Bone 33(4):721-732. 2003.

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2. Estudio del mecanismo de acción del monofluorofosfato de sodio y los bisfosfonatos sobre la remodelación ósea en modelos de osteoporosis en la rata.

Integrantes: Med. María Lorena Brance, Dr. Lucas Brun, Lucas Arias, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por CONICET (PIP 2009-2011)
Proyecto subsidiado por la Fundación A. J. Roemmers (2009-2011)

Objetivo General
Hallar un esquema de administración secuencial combinado de drogas osteoformadoras y antirresortivas de manera de modificar la remodelación ósea y producir un aumento de la masa ósea en la rata.

Objetivos Específicos
1. Evaluar el efecto sobre la masa ósea de un tratamiento osteogénico y antirresortivo secuencial con monofluorofosfato (MFP) y bisfosfonatos (BF) en modelos experimentales de osteoporosis.
2. Evaluar los cambios en la remodelación ósea inducidos por la administración de dieta hipocálcica, tratamiento con MFP, administración de dieta hipercálcica y bisfosfonato en un esquema secuencia basado en el conocimiento de la cinética de las unidades multicelulares básicas (BMU) del hueso.
3. Investigar el rol de MFP en el proceso de diferenciación y proliferación de los osteoblastos.

Antecedentes
La pérdida de masa ósea es un problema de salud pública. Las drogas utilizadas para evitar esta pérdida modifican la remodelación ósea, proceso por el cual el hueso mantiene su estructura y funciones. Los tratamientos utilizados se encuentran en etapa de desarrollo, sus mecanismos son motivo de estudio y están orientados a modificar la resorción o formación por separado. Existen pocos trabajos en los que se ha intentado modificar ambos procesos.
La remodelación ósea es un mecanismo secuencial que comienza con la resorción a cargo de los osteoclastos (duración aproximada: 10 días) que liberan citoquinas que actúan sobre la diferenciación y proliferación de los osteoblastos. Luego de una fase de reversión de aproximadamente 10 días, los osteoblastos rellenan con matriz ósea el defecto producido (duración aproximada 150 días). Finalmente la matriz se calcifica. Se denomina unidad multicelular básica (BMU) a la zona del tejido óseo donde ocurren estos procesos y es evidente que una droga osteoformadora no hará efecto durante la fase osteoclástica y lo mismo ocurrirá con una droga antirresortiva durante la fase de formación. Las BMU no se encuentran en fase, mientras una está en etapa de resorción, otra puede estar en reversión, formación o calcificación.
En este proyecto se propone la manipulación secuencial de los mecanismos involucrados en la remodelación ósea de manera de producir aumento de la masa ósea. El estudio de los eventos producidos por esta manipulación a través de experimentos in vivo aportarán conocimientos sobre los mecanismos moleculares involucrados. No existe información o experimentación donde se haya intentado controlar la secuencia de remodelación con fines de modificar la masa ósea.

Remodelación ósea: es el proceso por el cual el tejido es renovado e implica dos procesos: la resorción ósea a cargo de los osteoclastos y la formación ósea a cargo de los osteoblastos. Este mecanismo es necesario para mantener el correcto funcionamiento del esqueleto y en condiciones normales, resorción y formación, ocurren en igual proporción [1]. Desbalances hormonales, cambios en la actividad física, modificaciones alimenticias y presencia de otras patologías pueden modificar la relación entre resorción y formación, conduciendo a pérdida de la masa ósea, deterioro de la microarquitectura y aumento del riesgo de fractura [2]. La resistencia a la fractura está determinada por las propiedades geométricas, la actividad de las células y las propiedades materiales del tejido óseo. Estas últimas incluyen el contenido mineral, la composición mineral, el tamaño del cristal y el contenido de matriz, así como su composición [3].

La ovariectomía (OVX) en ratas es el modelo animal de pérdida de masa ósea postmenopáusica más utilizado, siendo las características de dicha pérdida comparables a los de la mujer postmenopáusica. Se observa un rápido aumento de la remodelación ósea luego de la OVX, con balance óseo negativo donde la resorción sobrepasa la formación [4]. Este efecto es observado al día 14 post OVX y a los 30 días ya están establecidos todos los cambios óseos, que se mantienen durante 12 meses [5]. El modelo de osteoporosis inducida por glucocorticoides permite el estudio de la remodelación ósea con función estrogénica conservada considerándose un modelo de osteoporosis por envejecimiento [6].
La remodelación ósea puede ser modificada por drogas antiresortivas y osteoformadoras. Entre las primeras, los bisfosfonatos son los más utilizados, cuyo efecto es el freno en la acción de los osteoclastos y la disminución de la apoptosis de los osteoblastos. Por otro lado las drogas osteoformadoras como la parathormona y el fluoruro no son de amplia difusión, la primera por el costo y la segunda por haberse hallado resultados no siempre beneficiosos.

Fluoruro de sodio (NaF) y monofluorofosfato de sodio (MFP)
El fluoruro es un mitógeno de las células óseas que produce incremento de la masa ósea, produciendo inhibición de una tirosin fosfatasa del osteoblasto, potenciando así el efecto de factores de crecimiento [7,8]. Las drogas más utilizadas como fuente de fluoruro en terapéutica humana son el NaF [9] y MFP [10]. Las farmacocinéticas del MFP y el NaF son diferentes [11,12]. A igualdad de dosis, el hueso de ratas tratadas con MFP presenta un contenido de flúor óseo superior a las tratadas con NaF, estando parte de este flúor ligado a proteínas [13]. Así la biodisponibilidad de flúor cuando se administra MFP es el doble de la biodisponibilidad que si se utiliza NaF en dosis equimolares. Luego de administrar NaF, en plasma se encuentra fluoruro como especie predominante. En cambio, luego de una dosis oral de MFP, además del fluoruro, se absorbe en estómago MFP que se liga a la alfa-macroglobulinas (AM) del plasma [11,14. Las AM pierden su actividad biológica cuando se ligan al MFP in vitro e in vivo [15] siendo depurado del plasma por receptores del hueso e hígado. Estos receptores (LRP) actúan como correceptor en el proceso de diferenciación de osteoblastos bajo la acción de las proteínas Wnt. Posteriormente, ambos tejidos liberan péptido/s de bajo peso molecular. En plasma de pacientes tratados con MFP se encuentran péptidos de peso molecular similar[16]. Además, en hueso se hallan péptidos de mayor peso molecular con flúor ligado y al suspender el tratamiento, estos péptidos disminuyen su concentración aumentando los péptidos de menor peso molecular y el fluoruro ligado a la fluorapatita, no produciéndose modificación del contenido total de fluoruro. Se postula que estas transformaciones producirían un aumento local de la concentración de fluoruro, que estaría actuando como estímulo del crecimiento óseo.
En sujetos tratados crónicamente con MFP, luego de 10 hs de una dosis de MFP, sólo se encuentra elevada la fracción de flúor ligada a las proteínas [17]. Una ventaja adicional del MFP es que el flúor ligado a proteínas, a diferencia del fluoruro, no tiene el efecto indeseable inhibitorio de la secreción de insulina [18,19,20].

Diferenciación de osteoblastos
La remodelación ósea es el resultado de la acción de osteoblastos y osteoclastos, células que se originan a partir de precursores del mesénquima y de la médula ósea, respectivamente. La diferenciación y proliferación de osteoblastos a partir de células pluripotentes del estroma de la médula ósea involucra a las cascadas de señalización del sistema Wnt/beta-catenin. Los osteoblastos poseen expresión del receptor LRP. La acción de Wnt sobre el osteoblasto requiere la heterodimerización del receptor LRP y el receptor Frizzled [21]. El receptor LRP reconoce a la AM luego de su inactivación, proceso que puede ser llevado a cabo por la unión a proteinasas o a moléculas como el MFP [15,16]. El complejo AM-MFP como los péptidos son captados por tejido óseo, indicando que los receptores de estos tejidos la reconocen.
Bien podría atribuirse el efecto del MFP sobre el hueso al fluoruro liberado por su hidrólisis. Sin embargo el mecanismo no parece ser igual al ejercido por el NaF, ya que al suspender el tratamiento, la masa ósea de los animales se mantiene elevada, respecto de los controles y los animales tratados con NaF, en los que la masa ósea se asemeja a los controles luego de 30 días. Los resultados mencionados sugieren una posible interacción del complejo AM-MFP con el receptor LRP de precursores osteoblásticos. Esta interacción podría aumentar la afinidad entre LRP y el receptor Frizzled, disminuir la acción de proteínas inhibidoras del receptor LRP como son las proteínas Dkk y esclerostin o la relación del receptor LRP con el co-receptor Kremen. En cualquiera de estas situaciones la acción de Wnt sobre los niveles de beta-catenina no fosforilada serían mayores.

Bisfosfonatos (BP)
Los bisfonatos  se unen al mineral óseo y pueden inhibir la resorción ósea por diversos mecanismos, actuando sobre el osteoclasto: por toxicidad formando análogos del ATP, inhibidores de la farnesil pirofosfato sintetasa y la prenilación de proteínas. Los bisfosfonatos disminuyen la adherencia del osteoclasto a la matriz ósea y aumentan su apoptosis. La inhibición del proceso resortivo se acompaña de la acción osteoblástica y de esta manera aumenta la masa ósea. El zoledronato tiene mayor potencia antirresortiva que otros BP y puede ser administrado menos frecuentemente [22]. Sin embargo, la matriz ósea es un depósito de factores de crecimiento que actúan sobre osteoblastos y la falta de acción del osteoclasto produce un detenimiento tanto de la pérdida de masa ósea así como de la formación ósea, impidiendo la remodelación ósea. Ha sido planteada la hipótesis que el uso combinado de drogas sería efectivo para el tratamiento de la osteoporosis basado en la teoría de poder disociar la formación y resorción óseas, incrementando la formación y disminuyendo la resorción [23]. Un tratamiento combinado con una droga anabólica y una antirresortiva podría tener efectos aditivos sobre la masa ósea.

Actividades y Metodología

Tratamientos y grupos experimentales
Se utilizarán ratas Sprague Dawley hembra adultas alimentadas con dieta balanceada. Se utilizará dieta hipocálcica e hipercálcicas en algunas de las etapas de los experimentos (ver adelante). Todos los experimentos serán llevados a cabo bajo las normas internacionales de cuidado y uso de animales de laboratorio [24]. Se llevarán a cabo experimentos en dos modelos de osteoporosis: ovariectomía y administración de glucocorticoides y se aplicará una terapia secuencial con drogas osteogénicas y antirresortivas de manera de lograr el máximo efecto sobre la remodelación ósea inclinando el balance hacia la formación ósea.
Osteoporosis inducida por ovariectomía: se realizará la ablación de los ovarios bajo anestesia con ketamina y xylazina [25]. Por 72 horas recibirán antibioticoterapia y analgesia.

En cada uno de los modelos se realizarán los siguientes grupos:
1- Tratados: ratas con osteoporosis inducida por corticoides (GC) y por ovariectomía (OVX) que recibirán secuencialmente dieta hipocálcica, dieta hipercálcica y MFP, dieta hipercálcica y zoledronato.
El MFP se administrará por vía oral en solución acuosa (40 umoles/100 g de peso corporal). El ácido zoledrónico se administrará por vía subcutánea una vez a la semana (1,5 ug/Kg de peso corporal). La dieta hipocálcica contendrá 0.4% de calcio, la normocálcica 1-1,2% y la hipercálcica 2%.
2- Controles: ratas con osteoporosis inducida por GC y OVX que recibirán agua destilada por sonda orogástrica y solución fisiológica por vía subcutánea en los períodos que los tratados reciben MFP o zoledronato. Estos animales serán alimentados con dieta normocálcica (1-1.2 % calcio).
3- Sham: Ratas que no son sometidas a OVX o tratamiento con GC. Aportarán datos normales a las diferentes edades investigadas, así como el peso del útero para evaluar en el grupo OVX el éxito de la cirugía.
Los animales del grupo tratado serán alimentados por 30 días con dieta hipocálcica. A continuación serán alimentados con dieta hipercálcica y diariamente se administrará MFP durante 60 días. Al finalizar este período se mantendrá la dieta hipercálcica y se administrará semanalmente zoledronato por 60 días.
Al principio del experimento y cada 30 días se colocarán 4 animales en jaulas metabólicas obteniéndose muestras de sangre y orina. Posteriormente a un día de control se realizará punción cardiaca para obtener sangre y producir la eutanasia por inyección intracardiaca de solución de KCl acorde a las normas internacionales [27] .
El efecto del tratamiento se evaluará por medida de masa ósea total [19], histomorfometría estática, densidad mineral ósea, comportamiento biomecánico de huesos largos y determinaciones bioquímicas de marcadores óseos en orina. El mecanismo molecular involucrado se estudiará por inmunohistoquímica.

Medición de la masa ósea total y contenido mineral total
Luego del sacrificio de los animales se separará la tibia izquierda para realizar histomorfometría, la tibia derecha para medidas de la densidad mineral por densitometría, el fémur derecho para medidas biomecánicas y el fémur izquierdo para medida de histomorfometría dinámica. El resto de la carcasa será digerida con papaína [28] y se procederá a la separación de los huesos y determinación del peso del esqueleto con el fin de evaluar la masa ósea. Luego los huesos serán incinerados, y con el peso de las cenizas se evaluará el contenido mineral total del hueso. El contenido de Ca y P será determinado sobre las cenizas.
La masa ósea total se calculará como: Masa ósea = peso esqueleto seco * 100/peso corporal, que expresa el porcentaje del cuerpo representado por el esqueleto.

Medición de la densidad mineral ósea
Se realizará con un equipo Lunar DEXA Prodigy con software para estudio en pequeños animales. Como plan de contingencia para este estudio las tibias serán radiografiadas con un equipo de rayos X simultáneamente con un patrón de aluminio calibrado contra concentraciones de calcio.

Histomorfometría ósea estática
Se realizará sobre cortes histológicos de hueso desmineralizado con EDTA. Se medirán parámetros estáticos: volumen óseo, volumen de osteoide, superficie de osteoide, espesor de la capa de osteoide, espesor trabecular, interfase hueso-osteoblasto, número de osteoblastos por mm2 de superficie ósea, superficie cubierta por osteoblastos, superficie de osteoclastos. De ser requerido se medirán índices dinámicos sobre microfotografías por fluorescencia de cortes sin descalcificar. Para lograr esta medición se realizará marcado con tetraciclinas por inyección 8 días y 3 días antes del sacrificio de los animales. La tetraciclina es incorporada en el tejido en mineralización. Se medirán los siguientes índices: Porcentaje de superficie trabecular con dos marcas de tetraciclina, velocidad de aposición de mineral, tiempo de retardo en la mineralización.

Marcadores de remodelación y formación ósea específicos para la rata
Se medirá deoxipiridinolina como marcador de resorción y osteocalcina como marcador de formación ósea.

Investigar el mecanismo de acción del MFP de sodio sobre las células óseas
Cortes histológicos obtenidos a partir de tibias descalcificadas con EDTA serán utilizados para medidas inmunohistoquímicas. Se realizarán estudios de doble marcación utilizando anticuerpo anti AM y anticuerpos anti LRP, con el fin de estudiar localización de ambas proteínas en el hueso. Se utilizará microscopia confocal láser de fluorescencia, contratándose el servicio en la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Se realizará independientemente la determinación inmunohistoquímica de RANK, receptor presente en osteoclastos [29]. La modificación en la expresión de las proteínas mencionadas permitirá evaluar el éxito del tratamiento y conocer en parte el mecanismo de acción del MFP.

Evaluación biomecánica de los huesos
Se realizarán experimentos de flexión a 3 puntos y estudios de compresión.

Referencias
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3. Rol de la fosfatasa alcalina en el mecanismo de absorción intestinal de calcio.

Integrantes: Dr. Lucas Brun, Med. Lorena Brance, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto en colaboración con el Dr. Millán, Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, USA

Antecedentes

La absorción intestinal de calcio (Ca) es, como la de todos los nutrientes esenciales, una función que debe estar perfectamente conservada dado que es fundamental para el desarrollo normal de la masa ósea durante la niñez y la adolescencia, y su conservación en la edad adulta. Por otra parte, alteraciones en su absorción no sólo tienen relevancia en la osteoporosis, sino que también se asocian a desórdenes de la conducción nerviosa, de la contracción muscular, de los mecanismos de transducción de señales, etc. La osteoporosis es un problema de Salud Pública de relevancia a nivel mundial. Se caracteriza por una pérdida de masa ósea y aumento del riesgo de fractura, habitualmente asociada a una disminución de la absorción intestinal de Ca. Estudios realizados en Argentina revelan que 2 de cada 4 mujeres mayores de 50 años de edad tienen osteopenia y 1 de cada 4 tiene osteoporosis [1].
La fosfatasa alcalina intestinal (FAi) es una enzima de membrana del enterocito que aún no tiene un rol fisiológico definido. Su localización principalmente duodenal y el hecho de que su expresión esté regulada por la vitamina D al igual que las proteínas que participan en la absorción transcelular de Ca, hacen sospechar un rol en el metabolismo mineral y en especial con el mecanismo de absorción de Ca.
El Ca se absorbe a nivel intestinal por dos mecanismos principales: 1) Transcelular: activo, de importancia principalmente en duodeno, saturable y de alta eficacia a bajas concentraciones de Ca luminal, 2) Paracelular: pasivo, de importancia a lo largo de todo el intestino, no saturable y efectivo en yeyunoíleon por la longitud de este segmento [2]. En el mecanismo transcelular participan una serie de proteínas: a nivel del ribete en cepillo del enterocito los canales de Ca TRPV6, a nivel intracelular la calbindina D9k y en la membrana basolateral la bomba Ca-ATPasa (PMCA1b) y el intercambiador Na/Ca (NCX1) [3].
Está demostrado que no es suficiente el incremento de la cantidad de Ca en la dieta para lograr una mayor absorción. Superando 1 g de Ca/día en la dieta, la absorción normalmente no supera los 600 mg/día y se incrementa simultáneamente el Ca fecal [4]. El intestino parecería defenderse de las ingestas masivas de Ca mediante disminución de la fracción de absorción del catión.
La fosfatasa alcalina es una enzima de membrana con actividad de hidrolasa de ésteres monofosfóricos. Se conocen varias isoenzimas e isoformas: ósea, hepática, renal, intestinal, placentaria, etc. A nivel plasmático las isoformas ósea y hepática constituyen más del 95%. Para la isoenzima intestinal se han reportado dos genes en la rata que codificarían a FAi I, de ubicación a lo largo de todo el intestino, y FAi II, de ubicación predominante duodenal [5]. En humanos la expresión es primordialmente por el gen ALPI y en el ratón hay 3 isoenzimas expresadas por los genes Akp3 (intestinal), Akp5 (germinal) y Akp6 (placentaria) [6].
Se expresan a nivel intestinal con un máximo en duodeno y una disminución gradual a lo largo de todo el intestino. Es secretada tanto hacia la luz intestinal como hacia el plasma y su expresión  coincide con el canal de Ca TRPV6 en enterocitos maduros [7]. Es un homodímero de 180 kDa, de pI 4.5 y pH óptimo 9-9.5. Como se mencionó anteriormente es llamativo que al igual que las proteínas involucradas en el mecanismo de absorción de Ca, su expresión es regulada por vitamina D [3,8].
Hallazgos recientes involucran a la FAi en el proceso de absorción de grasas [9]. Ratones knock-out del gen de FAi presentaron mayor transporte y absorción de grasa y ganancia de peso acelerada. Sin embargo, esto no invalida la posible relación con la absorción de Ca.
Trabajos realizados en nuestro laboratorio demostraron interacción FAi-Ca con modificación de la actividad y estructura de la FAi [10]. Se halló que la FAi fija 8 iones Ca por molécula de proteína en sitios independientes y de igual afinidad [10]. Existe información sobre interacción Ca-fosfatasa alcalina en aves donde se reportó que a nivel intestinal existen dos isoenzimas, una Ca y otra magnesio dependiente [11]. Estudios histoquímicos con diferentes concentraciones de Ca in vivo, es decir con la enzima anclada a membrana, han demostrado un efecto estimulante del Ca sobre la enzima [12]. Experimentos con sacos intestinales evertidos en presencia de diferentes concentraciones de Ca luminal han demostrado cambios en el pH del contenido intestinal dependientes de la concentración de Ca luminal [13]. Dado que el canal TRPV6 es regulado por el pH [14], se plantea la hipótesis que la FAi podría estar actuando como sensor de la concentración de Ca luminal y regulador del ingreso masivo de Ca por modificación de la actividad del TRPV6. Empleando dietas conteniendo diferente concentración de Ca se encontró un incremento del porcentaje de absorción de Ca cuando la enzima fue inhibida con L-fenilalanina 16 mM en el agua de bebida [15]. Esto último indicaría participación de la FAi en la absorción de Ca, lo cual justifica la profundización en este campo de estudio.

Hipótesis de Trabajo

Alta ingesta de Ca en una situación donde la dieta fuera baja en Ca por varios días produciría la entrada de Ca al enterocito con potenciales efectos tóxicos. Por lo tanto es lógico suponer la presencia de un mecanismo de regulación de la entrada de Ca en la membrana apical independiente de la vitamina D, que frene el ingreso de Ca masivo desde el lumen intestinal.
Esta función podría esta a cargo de la FAi a través de modificación de su actividad por la concentración de Ca luminal. La hidrólisis de ésteres fosfóricos por la enzima produce ácido fosfórico y reduce la secreción de bicarbonato por los enterocitos [16,17] y por ende regula el pH. La actividad del canal TRPV6 y FAi podrían estar relacionadas a través del pH de la superficie duodenal ya que se sabe que el canal TRPV6 se inhibe por la disminución en el pH [18,19].

Objetivo General

Investigar la regulación de la absorción intestinal de Ca ante la exposición a cantidades masivas del catión y la participación de la fosfatasa alcalina intestinal (FAi) en dicho mecanismo regulatorio.

Objetivos Específicos

1. Investigar la relación funcional entre FAi y la absorción de calcio en la línea celular Caco-2.
2. Investigar la absorción de calcio in vivo en ratones knock out del gen Akp3 que codifica a la FAi en comparación con ratones wild type.
3. Investigar la acción moduladora de la FAi sobre las vías de segundos mensajeros intracelulares.

Actividades y metodología               

Objetivo específico 1: Investigar la relación funcional entre FAi y la absorción de calcio en la línea celular Caco-2.

Se utilizará la línea celular Caco-2, línea celular humana derivada de adenocarcinoma colorectal. In vitro son capaces de polarizar y formar monocapas que retienen la expresión de distintas proteínas intestinales como la FAi. Son aptas para estudios de absorción y metabolismo de nutrientes. El uso de una línea celular se justifica por el hecho de que el cultivo primario de enterocito no ha resultado ser una técnica de simple aplicación y evita el sacrificio de un elevado número de animales.

La células se colocarán por 10 minutos ante diferentes concentraciones de Ca (0, 10, 50 y 100 mM) en  presencia o ausencia de L-fenilalanina como inhibidor de la FAi [20]. La captación de Ca se determinará empleando 45Ca como trazador radiactivo.
Luego de finalizado el tiempo mencionado el buffer de incubación se empleará para determinar la variación de pH del medio por acción de la FAi.
Las células se lavarán y lisarán para determinar la actividad de FAi ligada a membrana espectrofotométricamente. Asimismo se determinará la cantidad de enzima por Western blot.

Objetivo específico 2: Investigar la absorción de calcio in vivo en ratones knock out del gen Akp3 que codifica a la FAi en comparación con ratones wild type.

Se utilizarán ratones C57BL/6 knock out (Akp3-/-) (Dr. José Luis Millán - Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, USA) para evaluar la absorción de Ca en ausencia de la enzima. Se emplearán como controles ratones wild type que expresen la FAi. Con dichos ratones se llevan a cabo 2 tipo de experimentos:

1. Determinación in vivo del % de absorción de Ca basal y luego de recibir dietas conteniendo diferente concentración de Ca (0.2 g%, 1 g% y 2 g%) durante 30 días lo cual produce modificaciones de las proteínas que participan en el transporte transcelular de Ca. Previo al sacrificio se obtendrá plasma y orina para determinar calcemia, calciuria, fosfatemia, fosfaturia y niveles de vitamina D.

2. Finalizado el experimento anterior, los ratones se sacrificarán y se obtendrá el duodeno para aislar enterocitos y determinar captación de Ca a través de la incorporación de 45Ca como trazador radiactivo.
Las células se lavarán y lisarán para determinar la actividad de FAi ligada a membrana espectrofotométricamente. Asimismo se determinará la cantidad de enzima por Western blot. Asimismo se determinará la cantidad de FAi por Western blot. La expresión de proteínas del transporte de Ca tales como TRPV6, calbindina D9k, intercambiador Na/Ca, bomba Ca-ATPasa y VDR se determinarán por Western blot para asegurar que no existan modificaciones de las mismas en comparación con el ratón wild type y asegurar que los resultados se deban a la ausencia de expresión de la FAi.

En el caso de hallar diferencias en la absorción de Ca se procederá a evaluar en los ratones knock out del gen Akp3 que codifica a la FAi el efecto de dicha ausencia sobre la estructura del tejido óseo. Se realizará densitometría por DEXA (equipo Lunar DEXA Prodigy con software para pequeños animales), marcadores de remodelado óseo como deoxipiridinolina y FA total y ósea, determinación de minerales (Ca y P) en hueso, estudios biomecánica de flexión a 3 puntos sobre el fémur y estudios histomorfométricos para evaluar el tejido trabecular en tibia.

Referencias

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20. Fernley HN, Walker PG. Inhibition of alkaline phosphatase by L-phenylalanine. Biochem J.; 116(3):543-4. 1970

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4. Relevamiento del contenido de calcio en lácteos de uso masivo. Construción de una base de datos de acceso libre.

Integrantes: Dr. Lucas Brun, Med. María Lorena Brance, Daniela Vicente, Tec. Hilda Moreno

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers. Año 2010

Introducción
El calcio es el catión más abundante en nuestro organismo y es esencial, no sólo en el tejido óseo en cuanto a la formación de tejidos calcificados, sino también a nivel intracelular para la excitabilidad y permeabilidad de la membrana plasmática, secreción exócrina, regulación enzimática, neurotransmisión, contracción muscular, segundo mensajero en los procesos de transducción de señales, entre otros. Sin embargo sólo el 1% del Ca2+ total del organismo está presente en forma iónica en los fluidos biológicos y como es de esperar, su nivel se encuentra regulado por hormonas como la parathormona (PTH) y la vitamina D que actúan principalmente sobre el hueso, riñón e intestino.
La absorción del calcio varía fundamentalmente a lo largo del ciclo de la vida, siendo la etapa de lactancia el período de mayor absorción, con un porcentaje que ronda un 55-60%; en la adolescencia estos valores descienden a un 35-40%, para establecerse aproximadamente en un 30% en la etapa adulta. A partir de la mitad de la vida en adelante, la eficiencia de absorción declina casi 0.2% por año, con un porcentaje adicional del 2% en la menopausia.
Con respecto al consumo de calcio, se observa una relación inversa con la eficiencia de la absorción: ésta disminuye a medida que la cantidad ingerida aumenta, siendo éste un mecanismo adaptativo de protección a las altas concentraciones de calcio luminal. Está comprobado que superando 1 g/día de calcio en la dieta la absorción normalmente no supera 500-600 mg/día y se incrementa simultáneamente el Ca2+ fecal.
El calcio se absorbe a nivel intestinal por dos mecanismos principales: 1) Transcelular: activo, de importancia principalmente en duodeno, saturable y de alta eficacia a bajas concentraciones de calcio luminal, 2) Paracelular: pasivo, de importancia a lo largo de todo el intestino, no saturable y efectivo en yeyunoíleon por la longitud de este segmento. El proceso absortivo se encuentra afectado por diferentes factores, como ser la copresencia de sustancias acompañantes de la dieta, el estado hormonal o alteraciones de la función del aparato digestivo.
Es común la administración de comprimidos de calcio para contrarrestar el déficit de la absorción ya sea por las causas mencionadas o por el bajo contenido de calcio de los alimentos. Sin embargo durante la terapéutica con calcio muchas veces se ignora cuanto calcio aportan los alimentos. Este desconocimiento muchas veces surge de la falta de tablas nutricionales completas que permitan conocer el real contenido de calcio de los alimentos. La población desconoce habitualmente cuanto calcio ingiere y reacciona a las ingesta movido por publicidades desconociendo aun cuanto debería ingerir.
Este proyecto prevé generar una base de datos actualizada y actualizable del contenido de calcio en los alimentos. La misma proveerá información precisa a los profesionales de la salud y por el otro lado permitirá generar un software sencillo que permita a la población conocer su ingesta de calcio y compararla con los valores que debería ingerir. Ambas producciones que resulten de este proyecto serán de libre acceso a profesionales y población en general.

Objetivo General
Establecer un mecanismo de evaluación-control de la concentración y biodisponibildad de nutrientes en alimentos naturales y modificados con fines nutricionales.

Objetivos Específicos
1- Evaluar el contenido de calcio en los alimentos normales o enriquecidos de utilización en el ámbito nacional.
2- Proveer a los profesionales de la salud de datos precisos del contenido de calcio, favoreciendo el racional uso de medicamentos.
3- Establecer un sistema de medición y evaluación del contenido de calcio independiente de las empresas involucradas en el sector productivo.
4- Realizar un software de libre acceso calculador de consumo de calcio

Materiales y Métodos
Se realizará un muestreo de los diferentes productos lácteos y no lácteos enriquecidos con calcio, o que contienen naturalmente estos nutrientes en cantidad importante. Las muestras serán obtenidas de locales de venta de los productos y no se solicitarán muestras a las empresas productoras. El muestreo se realizará en diferentes ciudades de la provincia y en 4 días distintos. Se estima que al incluir el total de productos lácteos en circulación producirá aproximadamente 400 observaciones.
Las muestras serán fraccionadas y reservadas a –20°C para la realización de las  determinaciones en forma simultánea. En las muestras en la etapa correspondiente a este proyecto se determinará calcio. Las muestras se reservarán para posterior estudio de otros nutrientes: vitamina D, proteínas totales, hidratos de carbono, lípidos totales, etc.
 
Determinación de calcio
Las muestras serán incineradas para liberar el calcio de las posibles asociaciones con biomoléculas y se disolverán en solución levemente ácida. Las determinaciones se realizarán por triplicado y utilizando dos metodologías diferentes.  
Se realizará por espectrofotometría visible (CaColor, Wiener Lab, Rosario Argentina) y por espectrofotometría de absorción atómica (Arolab MK II).

Software de calculador de consumo de calcio
Se realizará un software de libre distribución para plataformas Linux y Windows. El mismo contendrá la base de datos que será actualizable a través de la página web mencionada. Este software permitirá el cálculo de la ingesta diaria de calcio de cada individuo de manera personalizada en función de los alimentos habituales que consumo, sexo y edad.

Con los datos obtenidos se creará en el sitio web del Laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario (www.biologiaosea.com.ar) una base de datos con acceso libre y gratuito a toda persona interesada en el tema.
Simultáneamente se publicarán los datos en la revista Actualizaciones de Osteología, órgano de difusión de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral, la cual está dirigida a profesionales relacionados al metabolismo mineral, como endocrinólogos, reumatólogos, nutricionistas, etc. La misma se encuentra con acceso libre y gratuito en  http://www.osteologia.org.ar e indizada en las siguientes bases de datos:  EBSCO, Latindex, LILACS, SIIC Dtata Bases y Scopus & Embase.

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5. Determinación de los niveles de calcio y vitamina D en alimentos de importancia en el crecimiento y la osteoporosis.

Integrantes: Dr. Lucas Brun, Lic Maela Lupo, Méd. María L Brance, Tesinista Daniela Vicente, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación. Gobierno de Santa Fe

Objetivo General
Establecer un mecanismo de evaluación de la concentración y biodisponibildad de nutrientes en alimentos naturales y modificados

Objetivos Específicos
1- Evaluar el contenido de calcio y vitamina D en los alimentos normales o enriquecidos con ambos nutrientes de utilización en el ámbito nacional
2- Evaluar la biodisponibilidad de calcio de los mismo
3- Proveer a los profesionales de la salud de datos precisos e independientes del contenido de los nutrientes, favoreciendo el racional uso de medicamentos.
4- Generar en las instituciones con fines de lucro la conciencia sobre la existencia de controles gubernamentales e independientes.

Materiales y Métodos

Objetivo específico 1
Evaluar el contenido de calcio y vitamina D en los alimentos normales o enriquecidos con ambos nutrientes de utilización en el ámbito nacional

Se realizará un muestreo de los diferentes productos lácteos y no lácteos enriquecidos con calcio y vitamina D, o que contienen naturalmente estos nutrientes en cantidad importante. Las muestras serán obtenidas de locales de venta de los productos y no se solicitarán muestras a las empresas productoras. El muestreo se realizará en diferentes ciudades de la provincia y en 4 días distintos. Se estima que incluir el total de productos lácteos de circulación producirá aproximadamente 400 observaciones.
Las muestras serán fraccionadas y reservadas a –20°C para la realización de las  determinaciones en forma simultánea. En las muestras en la etapa correspondiente a este proyecto se determinará calcio y vitamina D. Las muestras se reservarán para posterior estudio de otros nutrientes: proteínas totales, hidratos de carbono, lípidos totales, etc.
 
Determinación de calcio
Las determinaciones se realizarán por duplicado y utilizando dos metodologías diferentes.
Se realizará por espectrofotometría de luz visible (kit comercial, CaColor, Wiener Lab, Rosario Argentina) y por espectrofotometría de absorción atómica (Arolab MK II). En este ultimo caso las muestras se diluyen en una solución de cloruro de estroncio al 2% para eliminar interferencias por aniones que complejan el calcio. Un volumen de esta solución se volatiliza en una llama acetileno-oxígeno y se mide la absorbancia que la misma tiene sobre luz proveniente de una lámpara de calcio. La concentración de calcio en la muestra se determina por la comparación con soluciones patrones de calcio procesados de la misma manera.

Determinación de vitamina D
Se realizará por espectrofotometría a 290 nm previa aislamiento de la vitamina D2 y D3 por dos cromatografias en capa delgada con mezclas de solventes [1]. Básicamente el método consiste en eliminar lípidos saponificables por tratamiento con KOH, precipitar los esteroles con digitonina, cromatografía en capa delgada para separar los vitámeros de la vitamina A, tratamiento con SbCl3 y realización de una segunda cromatografía en cap delgada. La zona de migración de la vitamina D se detecta por procesamiento simultaneo de patrones por pulverización de una solución de rodamina. Finalmente la zona se disgrega y disuelve en dietiléter y se realiza la medición en espectrofotómetro a 290 nm. Patrones de vitamina D se procesa simultaneamente, de manera de reducir las variaciones por pérdidas en los pasos de aislamiento.

Objetivo específico 2
Evaluar la biodisponibilidad de calcio.

Se realizarán experimentos con ratas Sprague Dawley en crecimiento (destete, 21 días) y en animales adultos (100 días). Los animales serán alojados en jaulas metabólicas individuales alimentados con agua ad libitum y recibirán diariamente por vía orogástrica diferentes dosis de los lácteos a estudiar de manera de tener 3 grupos: dieta hipocálcica (0.2%), normocálcica (0.9%) e hipercálcica (2%).
El tratamiento de los animales se realizará de acuerdo a las normas internacionales de cuidado y trabajo con animales [2]

Se controlará diariamente el consumo de calcio y se recolectarán las heces para determinar la absorción neta del catión. A partir de los datos obtenidos diariamente se calculará empleando las siguientes fórmulas 1) Absorción neta de calcio = calcio total ingerido - calcio excretado en heces y 2) Porcentaje aparente de absorción de calcio = [(calcio total ingerido - calcio excretado en heces) x 100] / calcio total ingerido. El calcio se determinará por espectrofotometría de luz visible o absorción atómica (ver determinacion de calcio).

Adicionalmente se realizarán experimentos de intestino aislado in situ [3,4]. Las ratas serán anestesiadas con uretano (120mg/100g de peso corporal) administrado por vía intraperitoneal y mantenidas en camillas termostatizadas. Durante el experimento la temperatura ambiente se mantendrá entre 21-22º C. Se aislarán 6 cm del duodeno in situ  mediante dos ligaduras, la primera a nivel del píloro. En el extremo distal se colocará un catéter, a través del cual se introducirá la solución a investigar y se obtendrán muestras del contenido luminal. La solución a investigar contendrá trazas de calcio  radioactivo (45Ca2+) el cual será utilizado para determinar la absorción del catión. La determinación de radioactividad del 45Ca2+ se realizará utilizando un contador de centelleo líquido Beckman LS 100C utilizando líquido de centelleo (Tolueno 65% V/V, alcohol absoluto 35% V/V, difeniloxazol 0.266% P/V). En cada muestra se determinaron las cpm con un error £ 2%.
Se tomarán muestras de sangre por la vena de la cola a diferentes tiempos (0, 5, 10, 15 y 20 minutos) para determinar la calcemia por espectrofotometría de luz visible (ver determinación de calcio).

Referencias

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6. Desarrollo de acciones para mejorar la ingesta de calcio a nivel poblacional a partir del uso de cáscara de huevo.

Integrantes: Dr. Lucas Brun, Nicolas Dri, Dra. Verónica Di Loreto, Lic. Maela Lupo, Med. Lorena Brance, Chef Damian Delorenzi, Gabriela Vidoret, Dr. Alfredo Rigalli,

Proyecto subsidiado por Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación. Gobierno de Santa Fe

Introducción
La deficiencia de calcio es un problema de salud que permanece latente hasta su aparición en la edad adulta, principalmente en mujeres postmenopáusicas. La suplementación con comprimidos debe realizarse por años, con un elevado costo y dificultades de adherencia al tratamiento. La ingesta de lácteos es la vía más adecuada para la provisión de calcio, por su alto contenido y elevada biodisponibilidad. Se contrapone a sus beneficios el elevado costo de los productos de mayor contenido (quesos) y la intolerancia a la lactosa. Luego de la lactancia la ingesta de calcio decrece por las razones expuestas. El calcio es casi inexistente en otros alimentos o su biodisponibilidad es baja.
La investigación de otras fuentes data de muchos años, sin embargo llama la atención el reducido número de trabajos, contrapuesto a  resultados sorprendentemente positivos sobre la densidad mineral ósea. Estos trabajos han sido realizados en centros de investigación de escaso renombre o en países en vías de desarrollo.
Una cáscara de huevo, habitualmente descartada, tiene un contenido de 1-2 g de calcio suficientes para cubrir el 100% del requerimiento diario en humanos. Han sido utilizadas con éxito en animales. En ratas se demostró que produce similares resultados que el carbonato de calcio, pero sin producir hipercalcemia cuando es acompañado de vitamina D. En seres humanos se demostró un aumento de la densidad mineral ósea vertebral y en cadera de mujeres postmenopáusicas. La adhesión al tratamiento fue buena, pero no se informa sobre la tolerancia ni de la forma de procesamiento.
El calcio proveniente de las cáscaras de huevo tiene bajo contenido de fosfato (que disminuye la absorción) y sería tan soluble como el calcio proveniente de los lácteos, debido a proteínas acompañantes que estimularían su absorción.
La cáscara de huevo podría ser fuente de otros minerales relacionados a la salud ósea y dental, como el fluoruro  y el estroncio. Sin embargo su contenido es desconocido.

Objetivos específicos

1- Evaluar el contenido de calcio en cáscara de huevo
2- Desarrollar metodologías para el procesamiento de la cáscara de huevo a nivel doméstico.
3- Modificar recetas de alimentos de consumo masivo de manera de incrementar el contenido de calcio por adición de cáscara de huevo y evaluar la influencia sobre el sabor.
4- Evaluar la biodisponibilidad de las preparaciones con cáscara de huevo.
5- Difundir los resultados a través de medios de difusión masivos (páginas web, ong, diarios, programas de difusión)
6- Organizar reuniones informativas para maestros de escuelas informando sobre la utilización de esta fuente de calcio.
7- Elaborar un software y tablas de acceso gratuito con el contenido de calcio de los alimentos que permita diseñar una dieta con la adecuada provisión de calcio.

Materiales y Métodos

Procesamiento de muestras sólidas
Los productos que se utilicen en este proyecto se pesarán con balanzas de tipo analítico o preparativo dependiendo del material. Para pesadas de materiales destinadas a determinaciones bioquímicas utilizarán balanzas Mettler sensibilidad 0,1 y 0,01 mg.  Para la pesada de materiales para la preparación de comidas se utilizarán balanzas analíticas electrónicas de sensibilidad 0,1 y 1 g, dependiendo de la masa medida. En todos los casos la balanza utilizada será elegida de manera que el error cometido en el procedimiento sea inferior al 0.1%.

Procesamiento de cáscara de huevo para determinaciones de laboratorio
Las cáscaras de huevo serán molidas con un micro-molino. El polvo obtenido será utilizado en estas condiciones o luego de tratamientos químicos para transformarlo en solución. Para los estudios de laboratorio que involucran análisis de minerales, el polvo se calcinará en un horno a 550ºC y luego se disolverá en agua por tratamiento con ácido en cantidad necesaria.

Determinaciones bioquímicas

Contenido de calcio:  se determinará utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica. Las muestras se procesarán de manera de obtener una solución límpida, a partir de la cual se preparará una dilución con agua destilada y  SrCl2 al 2% para eliminar interfirientes. Se utilizará una curva de calibración con concentraciones de calcio 0-100 ug/ml y la llama utilizada para la determinación se obtendrá por mezcla de acetileno:aire en proporción 1,5:1. Con los valores de concentración de calcio halladas y la masa de muestras procesadas se obtendrá el contenido de calcio expresado en me de Ca/g de muestra.

Contenido de fósforo: El fósforo inorgánico se medirá utilizando un equipo comercial FOSFATEMIA UV AA  Wiener Lab, Rosario, Argentina. El método se fundamenta en la reacción del fósforo con el molibdato en medio ácido y la formación de un complejo fosfomolíbdico. La determinación utilizará 5 ul de muestra y simultáneamente se procesará una solución patrón de 4 mg/dl de fosfato, con la que se construirá una curva de calibración. La absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentración de fósforo inorgánico en la muestra, la que se determinará utilizando un espectrofotómetro.

Contenido de fluoruro: se realizará por potenciometría directa con un electrodo de ión específico y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analógico digital. La determinación se basa en la relación lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentración de flúor en las muestras o patrones utilizados. Simultáneamente con las muestras se procesan soluciones patrones de NaF de 10-3 M- 10-6 M]. A las muestras y las soluciones patrón se les adiciona un 10 % de buffer ácido acético/acetato de sodio 2 M para ajustar pH a 5-5.5 y homogeneizar la fuerza iónica de las soluciones. La técnica requiere muestras de 50 ul o más.

Contenido de sodio y potasio: Se realizará con un fotómetro de llama. Se utilizará una llama generada por gas natural y aire comprimido.  Se procesarán simultáneamente testigos de ambos iones  y las muestras se procesarán en diluciones adecuadas.

Contenido de cloruro: El contenido de cloruro de las muestras se realizará por potenciometría directa con une electrodo selectivo.

Contenido de sulfato: Se determinará por precipitación con bario radioactivo (133Ba) y la radioactividad se medirá en un contador de radiación gamma.

Contenido de estroncio: Se determinará por espectroscopia de absorción atómica utilizando una lámpara de emisión de estroncio. Las muestras se procesarán de la misma manera que para la medición de calcio pero sin el agregado de SrCl2.

Estudios de biodisponibilidad
Se utilizarán ratas Sprague-Dawley adultas del bioterio de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario. Los animales serán alojados en jaulas metabólicas individuales alimentados con agua ad libitum. En las primeras 24 horas serán alimentadas con la dieta habitual para roedores (Gepsa, Argentina) y se evaluará la absorción neta de calcio para obtener los valores basales de cada animal. En las siguientes 48 horas, se administrará por vía orogástrica una cantidad de preparación de cáscara de huevo con un contenido de calcio conocido y se evaluará nuevamente la absorción neta de calcio. De esta manera cada animal será considerado su propio control.
Se controlará el consumo de calcio y se recolectarán las heces para determinar la absorción neta del catión. A partir de los datos obtenidos diariamente se calculará empleando las siguientes fórmulas 1) Absorción neta de calcio = calcio total ingerido - calcio excretado en heces y 2) Porcentaje aparente de absorción de calcio = [(calcio total ingerido - calcio excretado en heces) x 100] / calcio total ingerido. El calcio se determinará por espectrofotometría visible o absorción atómica (Ver determinación de calcio).

Desarrollo de un tratamiento químico de cáscara de huevo para aplicación doméstica.
Se desarrollarán métodos de tratamiento químico de la cáscara de huevo de manera de obtener una solución que pueda ser utilizada para la adición a comidas. El procesamiento se realizará a través de soluciones ácidas de fácil acceso y disponibles en la cocina (vinagre y jugos cítricos). Simultáneamente se realizarán pruebas utilizando ácidos de calidad analítica (acético y cítrico). Se evaluarán diferentes tratamientos que permitan su utilización y descarten la posibilidad de contaminación por microrganismo presentes en la cáscara.

Desarrollo de un tratamiento mecánico de cáscara de huevo para aplicación doméstica
Se evaluarán la capacidad de pulverización de diferentes equipos de procesamiento disponibles en el mercado (batidoras, multiprocesadoras, licuadoras, miniprocesadoras).

Diseño de un equipo para moler cáscara de huevo
Se diseñará y construirá un equipo manual de bajo costo para utilización en el proceso de pulverización que actúe como sustituto de los procesadores comerciales descriptos en el párrafo anterior. Se cuenta con el asesoramiento de la industria Urani Ghella SA.
 
Adición de procesados de cáscara de huevo a alimentos
Se prepararán recetas tradicionales y/o de consumo masivo, especialmente en poblaciones de bajos y medianos recursos económicos. Se adicionará a las mismas los productos obtenidos por procesamiento de la cáscara de huevo de manera química o mecánica. Este proceso será  realizado y supervisado por los especialistas del grupo en esta materia (chef y nutricionista) que emitirá un dictamen sobre las características sensoriales de la comida preparada. Se establecerá la cantidad máxima posible que se podrá adicionar sin alterar las propiedades sensoriales de las comidas

Difusión
La difusión de los resultados se hará a través de la página web del laboratorio de Biología Ósea. donde se publicarán las formas de procesar la cáscara de huevo, la forma y cantidad a adicionar para obtener diferentes comidas. El laboratorio tendrá una dirección de mail para aclarar dudas sobre la utilización. Se utilizará la semana de la ciencia organizada por CONICET para difusión en escuelas. En estas actividades los investigadores visitan escuelas y charlan con alumnos y docentes sobre temas generados por la ciencia. Se cursará información a escuelas ofreciendo charlas sobre este tema.
Se ofrecerá al ministerio de educación la posibilidad que docentes primarios y secundarios asistan a jornadas de información gratuita que realizará el Laboratorio de Biología Ósea.
Algunos miembros del equipo tienen contacto en programas televisivos y radiales donde han difundido resultados anteriores y serán contactados para llevar adelante esta difusión.

Referencias

Knöfler EW.Egg shell therapy in calcium deficiency. An animal experimentBeitr Orthop Traumatol.1969;16(2):78-87.
Pánda B, Rao TS, Rao DS. Processing and utilization of egg shell as a source of calcium in animal feeds..Indian Vet J. 1965 42(10):773-7.
Hirasawa T, Omi N, Ezawa I. Effect of 1alpha-hydroxyvitamin D3 and egg-shell calcium on bone metabolism in ovariectomized osteoporotic model rats. J Bone Miner Metab.2001;19(2):84-8.
Masuda Y. Clin Calcium.. Hen's eggshell calcium. 2005 15(1):95-100
Schaafsma A, Pakan I. Short-term effects of a chicken egg shell powder enriched dairy-based products on bone mineral density in persons with osteoporosis or osteopenia. Bratisl Lek Listy. 1999 00(12):651-6.
Schaafsma A, van Doormaal JJ, Muskiet FA, Hofstede GJ, Pakan I, van der Veer E.    Positive effects of a chicken eggshell powder-enriched vitamin-mineral supplement on femoral neck bone mineral density in healthy late post-menopausal Dutch women. Br J Nutr. 2002 87(3):267-75.     
Daengprok W, Garnjanagoonchorn W, Naivikul O, Pornsinlpatip P, Issigonis K, MineY.  Chicken eggshell matrix proteins enhance calcium transport in the humanintestinal epithelial cells, Caco-2.  J Agric Food Chem. 2003  24;51(20):6056-61.
Rovenský J, Stancíková M, Masaryk P, Svík K, Istok R. Eggshell calcium in the prevention and treatment of osteoporosis. Int J Clin Pharmacol Res. 2003;23:83-92.
Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LR.  Determinación de la concentración de flúor en muestras biológicas. 1° Ed.  Editorial de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2007. ISBN 978-950-673-616-3
Guide for the care and use of laboratory animals, Nacional Institute of Health. Publication Nº 86-23, revised 1985.
Guide to the care and use of experimental animals. Vol1. 2nd Ed. 1993 Canadian Council on animal Care Guidelines. www.ccac.ca
De Candia F, Rigalli A, Di Loreto V. Anesthesia and Analgesia. En Experimental Surgical Models in the Laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratón. USA. 2009. Pag 21-30.
Brance ML, Brun LRM, Rigalli A. In situ isolation of the intestinal loop. En Rigalli A, Di Loreto V. Experimental Surgical Models in the Laboratory Rat. Editorial Taylor and Francis Group. CRC Press. Boca Ratón, USA. 2009. pp. 95-97.

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7. Evaluación del contenido de flúor en aguas de consumo de la provincia de Santa Fe. Relación con la salud dental y el riesgo de fluorosis.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Prof. Mirta Armendariz, Dra. María C. Aguire, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers. Año 2010

Introducción
El flúor (F) es un elemento de amplia aplicación en salud humana y la industria. En salud se lo emplea para el tratamiento de la osteoporosis y en la prevención de caries dentales (dentífrico, agua de bebida, etc). La utilización de aguas fluoradas es materia de discusión, ya que la ingesta de F por esta vía sumada a otras puede conducir a cuadros de fluorosis. Actualmente la exposición al F proveniente de fuentes naturales está aumentada. La utilización de aguas fluoradas produce ingestas mayores a las previstas ya que todos los alimentos preparados con dicha agua tienden a concentrar F. La utilización de compuestos con F es extensa: como pesticidas, en el pulido de pisos y en la conservación de maderas,  preparación de papeles de embalaje, alfombras y artículos textiles, el teflón, los CFC utilizados en refrigeración, industria del vidrio y del aluminio. Estas industrias generan gran cantidad de productos con F en forma soluble que contaminan suelos y aguas superficiales. Se suman los fertilizantes con fosfato que pueden contener hasta un 5% de F. Es importante tener en cuenta que el fluoruro de sodio es una sal altamente soluble, pudiendo  provocar alta bioacumulación en el agua. Los efectos tóxicos son dosis dependiente y están relacionados fundamentalmente a los niveles que el F alcanza en el plasma y los tejidos. Aun en baja concentraciones  el F interfiere la transducción de señales y afecta el ciclo celular.
Por lo expuesto, es previsible observar un incremento de la exposición al F por parte de la población como así también la aparición de fluorosis y sus complicaciones.
El riesgo de fluorosis no es sólo aplicable a humanos, ya que está demostrado el efecto del F en la disminución de la preñez de bovinos y la disminución del poder germinativo de semillas en suelos con alto contenido de F. El conocimiento del contenido de F en aguas y tierras cuenta con poca y antigua información. El último relevamiento se realizó en la decada de 1940 por OSN en la que no se muestrearon todas las poblaciones y no se dispone de la información certera sobre el tipo de agua estudiada, ni la técnica utilizada para la determinación.
Se ha iniciado un relevamiento del contenido de F en aguas de consumo de la provincia de Santa Fe, gracias al aporte realizado por la secretaria de Ciencias Tecnología e Innovación de la gobernación de la provincia. Se ha obtenido la colaboración de estudiantes de la UNR en el proceso de recolección de muestras y en la actualidad se carece de información de localidades alejadas y con pocos habitantes, pero de gran actividad agropecuaria.

Objetivos
1- Completar la información sobre el contenido de F en aguas y tierras de la provincia de Santa Fe.
2- Obtener información sobre el acceso de las poblaciones a aguas seguras en lo referente al contenido de F.
2- Establecer la ingesta de flúor en las diferentes poblaciones y estimar el riesgo de fluorosis.

Este proyecto permitirá completar un mapa sanitario sobre el contenido de F en aguas y suelos de la provincia de Santa Fe y su relación con las actividades socioeconómicas. Se podrá utilizar la información para sugerir sobre la necesidad de instalación de plantas potabilizadoras por ósmosis inversa y/o sobre el funcionamientode las actuales.
La relación entre los datos que se obtengan de la ejecución de este proyecto y los ya existentes permitirá establecer un pronóstico sobre la evolución del contenido de F en tierras y suelos, con la posibilidad de alertar sobre los niveles críticos del mismo.
Los datos obtenidos no solo serán de utilidad en salud humana sino tambien de aplicación al sector agropecuario.

Materiales y Métodos
En la actualidad se dispone de mediciones de flúor en aguas y tierras, obtenidas a partir de muestras recolectadas por alumnos de la facultad de Ciencias Médicas. Los alumnos han sido instruidos en la toma de muestra de manera de ser las mismas fiables. A pesar del esfuerzo realizado por el equipo del laboratorio en obtener muestras de la provincia, hay poblaciones que han quedado sin muestrear por no existir alumnos proveniente de las mismas. En este proyecto se procurará obtener muestras de dichas poblaciones y completar el mapa sanitario en lo referente al contenido de F y la disponibilidad de aguas de consumo seguras para la población.
* Viajes: están previsto tres viajes: noroeste, noreste y sur de la provincia, obteniendo muestras de agua y tierra, así como información relevante en lo que respecta a actividades socio-económicas (agricultura, industrias) que puedan modificar el contenido de F. Las muestras de agua se obtendrán de la red local de provisión, de pozos, de plantas de ósmosis inversa o de proveedores de aguas potabilizadas y soda. Las muestras se obtendrán en tubos de polietileno al igual que las muestras de suelos.
*  Determinación de F en agua: se realizará con un electrodo de ion específico y voltímetro digital. La determinación de flúor en tierra se realizará con el mismo electrodo previa destilación del flúor por tratamiento con ácido. El laboratorio cuenta con la metodología y equipamiento, optimizada para 100 muestras diarias.
* Obtención de un mapa de distribución de F. Se realizará un mapa detallando la distribución de F en aguas de consumo, aguas de pozos, de plantas de ósmosis inversa, aguas potabilizadas y tierra. Los valores serán correlacionados con los valores obtenidos por OSN hace aproximadamente 70 años. Se evaluará la evolución del contenido de F en los diferentes sectores de la provincia en relación con sus actividades socio-económicas
*Publicación de los resultados: los resultados que devengan de estas investigaciones se analizarán en conjunto con los de un proyecto previo y se pondrán a disposición de los profesionales de la odontología y la medicina. En principio serán publicados en la página web del Laboratorio de Biología Ósea, junto a recomendaciones respecto del consumo de agua y la utilización de la misma. Se presentarán en congresos regionales de profesionales de la medicina, veterinaria y odontología y se publicarán en revistas de acceso a los profesionales del área (Actualizaciones en Osteología y publicaciones de Círculos Odontológicos). Finalmente se intentará llegar a la comunidad profesional a través de la revista Medicina (BAires).
* Se informará a cada población mediante un informe escrito dirigido a los municipios respecto de medidas preventivas (de ser necesario).

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8. Relevamiento y monitoreo del contenido de fluoruro en aguas superficiales y profundas de la provincia de Santa Fe.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Prof. Mirta Armendariz, Dra. María C. Aguire, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación. Gobierno de Santa Fe

Antecedentes
El flúor (F) es un elemento de amplia aplicación en salud humana y la industria.
En salud se lo emplea para el tratamiento de la osteoporosis  y en el tratamiento y la prevención de caries dentales en dentífrico, colutorios, comprimidos y barnices dentales. La utilización de aguas fluoradas es materia de discusión. Los investigadores que sostienen el uso del F como preventivo en la aparición de caries, no desechan la posibilidad de fluorosis.  Actualmente la exposición al F proveniente de fuentes naturales está aumentada. La utilización de aguas fluoradas produce ingestas mayores a las previstas ya que todos los alimentos preparados con dicha agua tienden a concentrar F. La utilización de compuestos con F como pesticidas (fluoraluminato, sulfuril fluoruro y NaF), en el pulido de pisos (fluorsilicato) y en la conservación de maderas (KF)
En la elaboración de productos industriales se utiliza perfluoroctanansulfonil fluoruro en preparación de papeles de embalaje, alfombras y artículos textiles. El Teflón adiciona fluoruro a las comidas. Los cloro fluoro carbonos (CFC) utilizados como líquidos en refrigeración tienen asignados gran rol en la destrucción de la capa de ozono. El CaF2 y MgF2 son utilizados en la industria del vidrio y el espatoflúor en  la obtención de aluminio. Como dato alarmante se puede mencionar que en el primer trimestre del año 2005 se utilizaron 168000 toneladas de espatoflúor. Estas industrias generan gran cantidad de productos con fluoruro en forma soluble que contaminan suelos y aguas superficiales. Muchas industrias generan aerosoles que contienen fluoruro, entre estas se encuentran fundiciones de aluminio y zinc, plantas de enriquecimiento de uranio, fábricas de ladrillos y cerámica.
Los fertilizantes con fosfato pueden contener hasta un 5% de fluoruro. Cuando se utilizan con el fin mencionado se aportan entre 400-1000 g de fluoruro por hectárea que se incorporará a los vegetales de consumo humano  o al ganado que consuman el pastoreo.
Es importante tener en cuenta que el fluoruro de sodio es una sal altamente soluble, pudiendo alcanzar el valor de 1 mol/L, pudiendo provocar alta bioacumulación en el agua.
Los efectos tóxicos son dosis dependiente y están relacionados fundamentalmente a los niveles que el fluoruro alcanza en el plasma y los tejidos. En bajas concentraciones interfiere la transducción de señales y afecta el desarrollo del ciclo celular.
Por lo expuesto, es previsible observar un incremento de la exposición al F por parte de la población como así también la aparición de fluorosis y sus complicaciones.

Objetivo
Obtener un mapa de la concentración de minerales con potencial nocivo para la salud humana y animal en las aguas superficiales y profundas, en relación a las actividades económicas, estableciendo modelos matemáticos predictivos de cambios en la concentración (a largo plazo). En este proyecto y como primer etapa se estudiará el flúor.

Plan de trabajo

Recolección de muestras y actividades socioeconómicas
La recolección de muestras de aguas de la provincia se realizará con la colaboración de estudiantes de la Universidad Nacional de Rosario, oriundos de localidades de la provincia de Santa Fe. Las localidades que serán muestreadas son: Aaron Castellanos, Alberdi, Andino, Armstrong, Arroyo Seco, Cañada de Gómez, Capitán Bermudez, Carcaraña, Carlos, Pellegrini, Casilda, Chañar Ladeado, Colastine Norte, Diego de Alvear, El Trebol, Elisa, Esperanza, Figuiera, Fray Luis Beltran, Funes, Gato Colorado, Granadero Baigorria, Humberto, Las Rosas, Las Toscas, Logroño, Margarita, María Susana, Máximo, Paz, Moises Ville, Murphy, Piamonte, Pilar, Pueblo Ester, Puerto General San Martín, Rafaela, Reconquista, Ricardone, Rufino, San Carlos Centro, San Jorge, San José del Rincón, San Lorenzo, Santa Fe, Santo Tomé, Sastre, Sauce Viejo, Teodolina, Tostado, Venado Tuerto, Vera, Villa Constitución, Villa Gobernador Galvez, Villa MInetti, Virginia.

Las muestras de agua serán obtenidas por los alumnos en tubos de polietileno en un volumen de 1 mL en tres días diferentes. Las muestras serán conservadas a temperatura ambiente y serán procesadas para la determinación de flúor.
De la misma manera cada alumno realizará un relevamiento local de las industrias y actividades económicas de la región, haciendo hincapié en aquellas que producen desechos vertidos a sumideros o aguas superficiales.
Como método de control, un 10% de las poblaciones serán muestreadas directamente por los responsables de este proyecto

Determinación de la concentración de flúor [1]
En una primer etapa se realizará medición de la concentración de fluoruro y de flúor ácido lábil en el agua.

Medida de la concentración de fluoruro
Se realizará por potenciometría directa con un electrodo de ión específico Orion 94-09 y electrodo de referencia de plata/cloruro de plata, con lectura a través de un software específico previa captura de datos y digitalización de los mismos.
Las muestras de agua se estandarizan en fuerza iónica y pH por agregado de un buffer de ajuste en una proporción volumen muestra: volumen buffer = 10:1.
Simultáneamente se procesan soluciones estándar de fluoruro de sodio de concentraciones adecuadas a las muestras. La concentración de fluoruro en el agua se obtiene por obtención de la función de regresión entre los milivoltios desarrollados por los estándares en función del logaritmo de la concentración. Con los parámetros obtenidos de esta regresión se calculará la concentración de fluoruro en el agua, la que se expresará en ppm (partes por millón: mg/litro).
Simultáneamente se procesa una solución control, de concentración de fluoruro desconocida para el operador y las determinaciones son repetidas si la misma no pertenece al intervalo de confianza del 95%.

Medida de la concentración de flúor ácido lábil
Esta determinación permite medir la concentración de flúor que se encuentra formando compuestos poco disociados o ligados por enlaces covalentes sensible al tratamiento con ácidos. El fluoruro en presencia de calcio o fosfato puede formar compuestos que no son detectados por electrodo de ión específico, de la misma manera otros compuestos utilizados en
La determinación requiere la destilación isotérmica del flúor por tratamiento con ácido sulfúrico 6 N a 60 °C. El fluoruro desplazado de los compuestos por el tratamiento ácido es capturado por una solución de NaOH que se encuentra dentro de la misma cámara de destilación. Pasado 6 días de destilación, las cámaras se abren, y las trampas de NaOH se neutralizan con ácido acético glacial en dilución apropiada para obtener un pH final 5-5.5. Se ajusta el volumen de las muestras a un mismo valor final, habitualmente 50-100 ul y finalmente la concentración de fluoruro se mide como se indico en anteriormente.
Simultáneamente se procesan soluciones estándar de concentraciones adecuadas. La concentración de flúor acido lábil se obtiene por diferencia entre la concentración hallada luego de la destilación y la concentración de fluoruro obtenida por medida directa sin destilación. Los resultados se expresarán en ppm.

Análisis multivariado
La concentración de fluoruro y flúor ácido lábil de las muestras de agua de cada localidad o región se correlacionará con las actividades socioeconómicas. La concentración de flúor será considerada como una variable cuantitativa. 
Con respecto a las actividades económicas en un primer estudio se dividirán en: actividades agropecuarias: la que se subdividirá en agricultura y ganadería. Cada una de ellas tendrá un valor que oscilará entre 0 y 100%, de manera complementaria. Las industrias se clasificarán en metalúrgica, alimenticia, curtiembres, procesamiento de papel. Las diferentes actividades económicas de la región se tomarán como variables categóricas con dos niveles (1: si se presenta en la región y 0 si no se realiza).
La información se obtendrá a partir de datos recabados por los alumnos en sus respectivas ciudades y a través de información del ministerio de economía de la provincia de Santa Fe.

Modelos matemáticos
Establecidas las asociaciones entre concentración de fluoruro y flúor ácido lábil, se obtendrá funciones matemáticas que las relacionen. La repetición de las mediciones permitirá establecer la modificación a lo largo del tiempo [2].

Referencias
1. Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LR.  Determinación de la concentración de flúor en muestras biológicas. 1° Ed.  Editorial de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2007. ISBN 978-950-673-616-3
2. Rigalli A, Aguirre C, Armendáriz M, Cassiraga G. Formulación de Modelos Matemáticos de Fenómenos Biológicos. ISBN 950-673-371-6 . 1 ° Ed. 300 ejemplares.  Ed de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina 2003.

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9. Evalución del contenido de flúor en tierras de Santa Fe y su relación con la fluorosis y el crecimiento de cultivos.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Lic. Brenda Fina, Téc. Hilda Moreno, Martín Correa Luna (INTA), Prof. Mirta Armendariz, Dra. María C. Aguire, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación. Gobierno de Santa Fe. 2011

El fluoruro en cantidades mayores a lo recomendado puede conducir en animales a un cuadro clínico de fluorosis, cuadro que tiene su contraparte en vegetales.
La SECTeI subsidió la investigación sobre la distribución de flúor en aguas de Santa Fe. Este estudio concluyó que los valores de flúor en agua de pozo en el 72% de los casos se encuentran dentro de los parámetros aconsejables por OMS. La zona que supera los valores recomendados se ubica en la región sudoeste. En aguas de red, el 96% de los valores medidos se encuentran dentro de los aconsejados por la OMS.
Simultáneamente se obtuvieron muestras de tierras de 57 localidades. Los valores fueron más elevados que en las aguas y se observó mayor acumulación de flúor en tierras rurales, que hace sospechar un enriquecimiento como consecuencia de la actividad agropecuaria. No existen estudios que indiquen valores inocuos de flúor en tierra.
Los compuestos que contienen flúor pueden ser solubles o insolubles, por lo tanto podrían ser modificados por el regímen pluvial y la ubicación de las cuencas hídricas. No se han evaluado las especies químicas bajo las cuales se encuentra el flúor en la tierra, ni la disponibilidad de éste para los vegetales. La industrialización de ciertas zonas puede producir aumentos de lluvias ácidas en la región y conducir a liberación del flúor.
Estudios previos demostraron disminución en la germinación de semillas por agregado de fluoruro al agua [1]. Estos estudios fueron llevados a cabo con concentraciones de flúor 20 veces mayores que lo que se estima en nuestra provincia.
El flúor puede ser adicionado a tierras y por ende a aguas, como parte de productos agroquímicos [2]. Además, existen controversias sobre el contenido de flúor elevado de ciertos productos secundarios de la fabricación de fertilizantes [3,4].
Se demostró que los vegetales enriquecen su contenido en flúor en función del contenido de este elemento en el suelo en que crecen [5], existiendo escasa información sobre el efecto del contenido vegetal de flúor sobre el crecimiento de los cultivos. Existen algunos trabajos en los que se evaluaron efectos del fluoruro sobre actividades enzimáticas en plantas, pero las concentraciones utilizadas fueron 20 veces mayores que las halladas en agua [6]. Además es poco conocida la cantidad de flúor que se podría ingerir a través de vegetales que incorporan este elemento y su relación con la salud humana.
Se ha descripto  disminución de la preñez [7,8] y de la lactancia [9,10] en ganado. Se ha detectado también anormalidades fetales y abortos en mujeres residentes de zonas de fluorosis [11]. En años recientes este grupo de investigación detectó en zonas de Chubut fuentes de agua con contenido de flúor elevado, asociándose con una disminución en la preñez en bovinos y ovinos [12]. No hay estudios que permitan evaluar la ingesta de flúor por animales de pastoreo en función del contenido de flúor en vegetales.
Por todo lo mencionado anteriormente es que se han planteado los objetivos específicos de este proyecto, para determinar cómo y en qué medida podría el flúor estar afectando a la germinación, crecimiento y producción de las plantas de cultivo en nuestra provincia.

Objetivo específico 1: Obtener un mapa de la distribución de flúor en tierras de la provincia.
Se recolectarán muestras de tierra de diferentes sitios de la provincia. Como en el proyecto anterior, se contará con la colaboración de estudiantes de diferentes facultades oriundos de localidades de la provincia. Los mismos realizarán la recolección de muestras siguiendo instrucciones escritas. Un 10% de las localidades  serán muestreadas nuevamente por miembros del equipo de investigación de este proyecto para verificar su correcta recolección. Se determinará flúor en diferentes formas químicas: fluoruro, flúor ácido lábil y flúor en compuestos resistentes a la liberación por ácidos. El encargado de la medición desconocerá el origen de la muestra. Utilizando  los valores medidos y las coordenadas geográficas del lugar se confeccionará el gráfico correspondiente.

Objetivo específico 2: Determinar la fracción de flúor soluble e insoluble en tierras de la provincia.
Objetivo específico 3: Identificar las diferentes formas químicas en las que se encuentra el flúor.
Al realizar la determinación de flúor para cumplir con el plan del objetivo 1, se determinarán diferentes formas químicas bajo las cuales puede encontrarse el flúor: fluoruro, flúor ácido lábil y flúor ligado por enlaces resistentes a los ácidos. La proporción de fluoruro en la muestra indicará el contenido de flúor disponible que puede pasar al agua.

Objetivo específico 4: Evaluar factores físico-químicos que pueden aumentar la fracción biodisponible de flúor.
Los principales factores que pueden cambiar el tipo de compuestos bajo los que se encuentra el flúor en las tierras es el cambio de acidez del suelo (pH). Se evaluará el efecto de diferentes pH sobre el cambio de la proporción entre fluoruro, flúor ácido lábil y flúor ligado por enlaces resistentes a los ácidos.
Se evaluará este cambio en tierras, debido al tratamiento con soluciones ácidas y por los cambios generados en el suelo por el propio crecimiento de plantas. Se tomarán alícuotas de tierra de un cultivo de laboratorio, de la zona de la raíz y se monitorearán los cambios en las diferentes fracciones de flúor (ver metodología)

Objetivo específico 5: Determinar el contenido de flúor en vegetales y su relación con el contenido de flúor en agua y tierras. Evaluar su relación con la ingesta diaria de flúor recomendada en humanos.
Se medirá el contenido de flúor en vegetales de diferentes zonas y se analizará la relación que existe con el contenido de flúor en agua y tierras de la misma zona. En el momento de recolección de muestras de tierra se recolectarán vegetales de la misma zona.

Objetivo específico 6: Estudiar la capacidad germinativa, el crecimiento y metabolismo de las plantas de cultivo de la provincia en presencia de distintas concentraciones de flúor halladas en los suelos de regiones específicas.
Se realizarán en laboratorio cultivos experimentales de soja, trigo y maíz en los que se evaluará el poder germinativo, envejecimiento acelerado, crecimiento (medida hipocótilo y estudio microscópico), medidas de actividad fotosintética y de estrés (flavonoides). Estas mediciones se realizarán en cultivos con concentraciones de flúor en tierras utilizando en un primer lugar los valores extremos del rango de contenidos obtenidos al ejecutar el objetivo 1. Se compararán las variables mencionadas entre ambos grupos utilizando pruebas estadísticas adecuadas.

Objetivo específico 7: Determinar el contenido de flúor en productos agroquímicos.
Se realizará un muestreo de los principales compuestos agroquímicos (fertilizantes, herbicidas, inoculantes) utilizados en la provincia. Se determinará el contenido de flúor en los mismos y se calculará en función de su modo de empleo el agregado de flúor a la tierra.

Objetivo específico 8: Evaluar la relación entre contenido de flúor soluble e insoluble en tierras con el promedio anual de lluvias.
La lluvia podría ser una causa de cambio en el contenido de flúor en la tierra, especialmente de aquellas especies químicas que son solubles. Para evaluar esta relación se obtendrá el promedio anual de lluvias en diferentes sitios de la provincia y se correlacionará el mismo con el contenido de los diferentes tipos de compuestos con flúor en la tierra.

Objetivo específico 9: Relacionar el contenido de flúor en tierra con la producción agrícola del lugar.
Se correlacionará el contenido de las diferentes formas químicas de flúor en tierras  con la producción agrícola de cada región obtenida a partir de información de base de datos del IPEC: http://www.santafe.gov.ar/archivos/estadisticas

Objetivo específico 10: Evaluar el posible enriquecimiento en flúor de la tierra por la aplicación de riego artificial con aguas de napa.
Se realizarán experiencias en laboratorio, produciendo riego de cultivos, utilizando aguas con contenidos de fluoruro coincidentes con los valores de menor, medio y alto  contenido de flúor hallado en la provincia en la ejecución del objetivo 1. Se evaluará luego de un ciclo de crecimiento de las plantas, el contenido de flúor bajo sus diferentes especies, tanto en la tierra como en los vegetales que se estudien. En este caso el experimento se realizará en pequeños sectores utilizando verduras (lechuga o acelga), dado que el sector que recurre a riego es fundamentalmente el hortícola.

METODOLOGIA
Todas las determinaciones serán sometidas a un estricto control de calidad
Medida de la concentración de fluoruro: Se realizará por potenciometría directa con un electrodo de ión específico Orion 94-09, procesando simultáneamene estándares de fluoruro de sodio.
Medida de la concentración de flúor ácido lábil: Se realizará por potenciometría directa luego de destilación isotérmica  con ácido fosfórico concentrado a 60 °C.
Determinación de Poder Germinativo (PG): Este procedimiento se usa para determinar el porcentaje de semillas de un lote que serán capaces de producir una plántula normal bajo condiciones de germinación óptimas. Una determinada cantidad de semillas se siembran sobre una cama (de arena o tierra) cubriéndolas totalmente y se llevan a una cámara a 25°C con alternancia de 8hs luz y 16hs oscuridad. Luego de 5 días, se realiza la primer lectura, donde se cuentan las plántulas que emergen sobre el nivel del sustrato sin extraerlas, dato que será considerado como el de Energía Germinativa (EG). Las bandejas se colocan nuevamente en la cámara de 25ºC hasta el día de la lectura final, cuando se extraerán las plántulas y se observaran todas sus estructuras. Se clasifican en: plántulas normales, plántulas anormales, semillas muertas, semillas duras, semillas frescas no germinadas y semillas vanas. Los criterios de clasificación son los establecidos por ISTA y descritos en el Manual de Evaluación de plántulas (3ra Edición). Se considera PG a la cantidad de plántulas normales expresado como % del total de semillas sembradas.
Test de envejecimiento acelerado: El método más aconsejado para conocer el vigor de la soja es el test de envejecimiento acelerado, que consiste en someter las semillas a un estrés de temperatura a 41°C y humedad relativa del 100% durante 72 hs, con posterior determinación del poder germinativo.
Medida del hipocótilo en oscuridad: Se siembra una determinada cantidad de semillas en placa y se dejan 3 días en oscuridad. Al tercer día, se sacan una hora a la luz y se dejan en oscuridad por 6 días más. Finalmente, se extraen de la placa y se mide la longitud del hipocótilo.
Estudio microscópico: A distintas edades se efectúan cortes transversales y longitudinales de zonas marcadas en el hipocótilo apenas comienza a germinar. Se determinan parámetros celulares: espesor de tejidos y dimensiones celulares de los distintos tejidos  Simultáneamente, en la preparación se observa la existencia de material lignificado.
Medida de VO2: Se mide la velocidad de fotosíntesis a través de la velocidad de producción de oxígeno con un electrodo de Clark por parte de una hoja a la cual se le suministra luz y CO2  en una cámara herméticamente cerrada.
Determinación de flavonoides: Los flavonoides aumentan cuando a la planta se la somete a situaciones de estrés como puede ser la falta de agua, infecciones fúngicas o bacterianas, radiaciones UV y frío. La técnica consiste en la extracción de los flavonoides de la planta y su medida espectrofotométricamente.
Datos de bases de datos: Se utilizarán bases de datos de la provincia de Santa Fe disponible en la web (http://www.santafe.gov.ar/archivos/estadisticas).
Herramientas matemáticas e informática: Las correlaciones y análisis de datos se realizarán con los softwares: Graph Pad 2.0, MatLab 7.0, Origin 3.0 y R 2.9.2.

1. Sudhakar Pant,a Prabhakar Pant,b PV Bhiravamurthyc. Effects of fluoride on early root and shoot growth of        typical crop plants of india  Fluoride 4:57–60.2008.
2. Pang X, Li D, Peng A. Environ Sci Pollut Res Int. 2002;9(2):143-8.Application of rare-earth elements in the agriculture of China and its environmental behavior in soil.
3. Hallin IL, Naeth MA, Chanasyk DS, Nichol CK.J Assessment of a reclamation cover system for phosphogypsum stacks in Central Alberta, Canada.   Environ Qual. 39:2160-9. 2010
4.Gouider M, Feki M, Sayadi S. Bioassay and use in irrigation of untreated and treated wastewaters from phosphate fertilizer industry. Ecotoxicol Environ Saf. 73:932-8. 2010    
5. Stanley VA, Shaleesha A, Murthy PB, Pillai KS. Retarding fluoride accumulation in Amaranthes viridis through liming and implications of phosphorous treatment. J Environ Biol. 23:265-9. 2002
6. Ross CW, Wiebe HH, Miller GW. Effect of fluoride on glucose catabolism in plant leaves. Plant Physiol:305-309. 1961
7. McClure TJ. A review of developments in nutrition as it is related to fertility in cattle. N Z Vet J. 18:61-8. 1970. 
8. Suttie JW, Carlson JR, Faltin EC. Effects of alternating periods of high and low Fluoride ingestion on Diary Cattle. Journal of Diary Science. 55:6.1971
9. Yuan SD, Song KQ, Xie QW, Lu FY.An experimental study of inhibition on lactation in fluorosis rats. Sheng Li Xue Bao. 43(5):512-7. 1991         
10. Eckerlin RH, Maylin GA, Krook L. Milk production of cows fed fluoride contaminated commercial feed.Cornell Vet.76:403-14. 1986
11. Shi J, Dai G, Zhang Z. Relationship between bone fluoride content, pathological change in bone of aborted fetuses and maternal fluoride level. Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. Mar;29(2):103-5. 1995
12. Informe técnico producido a pedido de Cominagro SA. Trelew. Chubut. Argentina.

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10. Medida de la remodelación ósea utilizando fluoruro como trazador del proceso. Desarrollo de una técnica miniinvasiva para medida de la remodelación en ratas.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por CONICET (PIP 2009-2011)

Antecedentes

Generalidades
El tejido óseo se origina por dos mecanismos: osificación intramembranosa y osificación endocondral. Ambos procesos conducen a la formación de un mismo tipo de hueso, que luego se mantiene por el proceso de remodelación ósea, por el cual el tejido óseo se renueva. La remodelación ósea consta de dos procesos básicos que son: la resorción o remoción de tejido óseo y la formación de nuevo tejido en su lugar (siempre la resorción precede a la formación).La secuencia de remodelación es: activación, resorción y formación (secuencia ARF). La resorción ósea es el proceso por el cual se destruye el hueso. Los osteoclastos son las principales células encargadas de la resorción, también pueden producir resorción los osteocitos. Los monocitos y macrófagos participan en la resorción pero su rol es poco importante. Entre la etapa de resorción y la de formación, se da un proceso conocido como fase de reversión, en el cual las células mononucleares, como macrófagos, forman una capa de cemento que une el hueso neoformado con el tejido óseo existente.
Una vez formada la matriz ósea, el hueso se calcifica, proceso que se inicia por vesículas de matriz exocitada por osteoblastos, los cuales actúan como núcleos. La velocidad de mineralización depende de la presencia de pirofosfato, proteínas no colágenas acídicas de la matriz ósea y de la expresión de fosfatasa alcalina en la membrana del osteoblasto.
Normalmente los procesos de resorción y formación ósea están acoplados, es decir la resorción y formación proceden en igual magnitud. Estos procesos mantienen la estructura del hueso, removiendo hueso antiguo, con defectos o con microfracturas y rellenando con tejido óseo nuevo [1]. En algunas patologías el proceso de remodelación (resorción-formación) puede estar aumentado o disminuido respecto del valor normal, no siendo ninguna de las dos situaciones deseables.
La medición de la remodelación ósea es un proceso que ha sido encarado de maneras diferentes, dependiendo si se trata de necesidades clínicas o de investigación básica.

Diferentes formas de medición de la remodelación ósea
Una técnica utilizada para la determinación de la remodelación ósea es la histomorfometría ósea [2]. Requiere la toma de biopsias ósea y el procesamiento histológico del material. Se realiza sobre cortes histológicos de hueso sin desmineralizar, incluido en metilmetacrilato, teñidos con azul de toluidina o bien sobre cortes de tejidos en parafina con tinción con hematoxilina eosina. El análisis de los resultados puede dar medidas de la remodelación ósea, pero la dificultad es que informará respecto de la zona donde se obtuvo la biopsia. Existen diferentes tipos de índices: estáticos y dinámicos. Los parámetros que se pueden medir son numerosos y la aparición de software de análisis de imágenes ha contribuido a hacer estas mediciones de manera cuantitativa.
Otra técnica es por medio de la utilización de marcadores óseos, que son moléculas cuya concentración se puede medir en plasma y orina, e indican el estado metabólico del tejido óseo [3,4,5]. Sus concentraciones se detectan habitualmente por ELISA, IRMA o RIA. Existen diversas marcas comerciales y tipos de ensayos para cada uno. Los valores de referencia dependen de las marcas comerciales y la metodología utilizada. Los marcadores bioquímicos óseos son de amplia aplicación en la clínica, dan una medida global del esqueleto, pero sus datos no siempre se correlacionan con la clínica o la realidad dentro del tejido óseo. Además son costosos y en algunos casos no solo representan el estado de la remodelación ósea. Existen marcadores de resorción y formación ósea. Los marcadores de formación más utilizados son: fosfatasa alcalina total, fosfatasa alcalina ósea, osteocalcina (BGP). Entre los marcadores de resorción en la actualidad se dispone de hidroxiprolina, piridinolina (Pyr), deoxipiridinolina (D-Pyr), telopéptidos: NTX (amino terminal) y cross laps, catepsina K, sRANKL, péptido helicoidal.
Por último, se puede tener en cuenta, que el calcio y el fosfato son dos iones utilizados en la formación del cristal de hidroxiapatita, responsable de la calcificación del hueso. Existen iones que tienen afinidad específica por el tejido óseo y pueden ser utilizados como trazadores de dicho tejido. La captación de calcio radiactivo por el hueso [6] como la de algunos bisfosfonatos con trazadores radiactivos que reemplazan al fosfato en el cristal han sido utilizados como medida de la resorción ósea [7,8].
Existen otros iones que pueden ser intercambiados por otras partes del cristal, tal es el caso del estroncio y del fluoruro.
La medición de la remodelación ósea y los resultados obtenidos sigue siendo un problema en la clínica y en la investigación básica especialmente con animales, donde los marcadores bioquímicos óseos no están tan desarrollados

Estudios preliminares
En el laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario el fluoruro ha sido utilizado como trazador del tejido óseo [9]. En el trabajo citado se comparó la captación de fluoruro con la captación de metilbisfosfonato marcado con 99mTc. Se halló que en pacientes en los cuales se ve aumentado el proceso de remodelación ósea, como ocurre durante las bajas ingestas de calcio, la retención corporal de fluoruro se hallaba aumentada y esto, correlaciona adecuadamente con otros parámetros de la remodelación ósea como son la excreción urinaria de hidroxiprolina y de la fosfatasa alcalina ósea. Sin embargo la técnica carece de adecuada sensibilidad para detectar pequeños cambios, y como se determina por la excreción urinaria de fluoruro, el resultado puede ser erróneo si la persona esta consumiendo flúor de alguna fuente (agua fluorada). Esta técnica fue utilizada en seres humanos pero no se adecuó al uso en animales de experimentación.
La medición de la remodelación ósea en animales de experimentación es necesaria para evaluar el progreso del tratamiento con drogas que tienen efecto sobre el tejido óseo, cuando estas sustancias se encuentran en fase de desarrollo.
En el laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario se ha avanzado en la obtención de un modelo farmacocinético para el fluoruro de sodio y el monofluorofosfato de sodio [10,11,12]. Estos modelos vislumbran que a través de modificaciones en los mismos y la combinación con procedimientos quirúrgicos sencillos, podrían aportar una medida de la remodelación ósea en la rata, utilizando el fluoruro de sodio como trazador.

Objetivo general
Desarrollar un método de medición de la remodelación ósea en la rata utilizando fluoruro (F) como trazador del tejido óseo.

Objetivos específicos
• Desarrollar un modelo matemático para la medición de constantes farmacocinéticas del fluoruro de sodio en la rata, que permitan estimar la remodelación ósea.
• Desarrollar un método de cálculo para la obtención de los valores de dichas constantes.
• Desarrollar un método mini-invasivo de obtención de muestras biológicas para la determinación de las variables involucradas en el cálculo de las constantes farmacocinéticas.
• Obtener los valores de las constantes farmacocinéticas en ratas normales.
• Obtener los valores de las constantes farmacocinéticas en situaciones donde la remodelación ósea se encuentre modificada
• Desarrollar un software para la determinación de las constantes farmacocinéticas

Metodología

Plan para dosis intravenosa (i.v.)

Se desarrollará un modelo matemático que permita medir la velocidad de captación de fluoruro por el hueso luego de una dosis intravenosa de fluoruro de sodio. La ventaja de este método radicaría en que se eliminarían los procesos gastrointestinales de absorción, de difícil cuantificación, y permitiría un mejor control de la dosis a administrar.

Requisitos:
• Este método se llevara a cabo por medio de una dosis intravenosa de solución de fluoruro de sodio de concentración adecuada a la línea y peso del animal.
• Es necesaria la utilización de anestesia para poder realizar la inyección intravenosa.
• Se obtendrán muestras de sangre con anticoagulante.

Cálculo teórico de dosis de NaF i.v.:
La cantidad de fluoruro a inyectar se calculará en función del peso del animal, la volemia, y la concentración de fluoruro plasmático máximo tolerado sin cambios apreciables en la salud del animal.

Materiales y Métodos

• Herramientas matemáticas de análisis:

1. Planteo de ecuaciones diferenciales [13-16]
2. Resolución de ecuaciones diferenciales por transformadas de Laplace [17]

• Planteo de modelos biológicos:

Se utilizarán ratas normales, hembras, de 7 semanas de vida (adultas). Se trabajará con ratas hembras dado que la pérdida de tejido óseo asociado a la disminución de la función ovárica es un tema de interés en la salud humana, por la incidencia de osteoporosis en mujeres postmenopáusicas. El trabajo con ratas hembras permitirá analizar la remodelación ósea en modelos que reproducen esta situación.
También se utilizarán ratas normales hembras o machos, a las cuales se les realizará cirugías como paratiroidectomía, etc., para validar el modelo en ratas en las que la remodelación ósea se vea modificada.

• Trabajos con ratas [18]

1. inyección intravenosa a través de la vena de la cola.
2. Administración de sustancias por sonda gástrica.
3. Recolección de orina en jaulas metabólicas.
4. Obtención de sangre de la punta de la cola y de vena de la cola
5. Cirugías para la producción de animales con remodelación ósea modificada (por ejemplo ovariectomía y paratiroidectomía)

• Eutanasia de los animales:
Cuando se lo requiera los animales serán sacrificados por una inyección intracardíaca de 0.5 ml de KCl saturado, con el animal en profundo estado de analgesia y anestesia (inhalatoria con éter sulfúrico o inyectable con ketamina y xilazina)[19].

• Anestesia:
En función del avance en la metodología se optará por anestesia inhalatoria con éter sulfúrico o por vía intramuscular con xilazina y ketamina [18]. De ser necesario se utilizará anestesia local con Clorhidrato de lidocaína y analgésicos.

• Cuidados del criadero
Cuando se mantengan animales en criadero, se utilizará un ambiente climatizado (24-27 °C), con ciclo luz-oscuridad (12 hs - 12 hs). Los animales recibirán alimento balanceado para roedores y agua ad-libitum.

• Determinaciones de la concentración de flúor [20]:

1. En plasma: se utilizará potenciometria post-destilación isotérmica. La técnica utiliza (50-100) μl plasma [21].

2. En orina: se utilizará potenciometria directa (100 μl orina). La orina es un fluido donde por lo general no existen concentraciones importantes de metales trivalentes que complejan el fluoruro. Por lo tanto, la medición potenciométrica de fluoruro puede llevarse a cabo ajustando el pH de la muestra y la fuerza iónica.

La determinación se realiza con un electrodo de ión específico Orion 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl. El voltaje desarrollado es directamente proporcional al logaritmo de la concentración de fluoruro en la muestra. Se procesan simultáneamente patrones acuosos de NaF de concentraciones adecuadas a las muestras. El ajuste de curvas de calibración se realizará utilizando softwares adecuados (Prism.Graph Pad 2.0, Origin 3.0) con el método de los mínimos cuadrados.


Referencias
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2. Parfitt AM..Bone histomorphometry: proposed system for standardization of nomenclature, symbols, and units. Calcif. Tissue Int. 1988, 42:284-286
3. Delmas PD, Wahner HW, Mann KG, Riggs BL. Assessment of bone turnover in postmenopausal osteoporosis by measurement of serum bone Gla-protein. J. Lab. Clin. Med. 1983, 102:470-475.
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5. Puche RC, Caferra DA, Rosillo I. Bone isoenzyme of serum alkaline phosphatase measured with wheat germ agglutinin. Clin. Chem. 1988, 34:219-225.
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8. Thomsen K; Rodbro P, Christiansen C. Bone turnover determined by urinary excretion of 99m-Tc diphosphonate in the prediction of postmenopausal bone loss. Bone Miner. 1987, 2:125-132..
9. Puche RC, Rigalli A, Trumper L, Dip O, Pereyra JL, Poudes G, Roberti A, Bocanera R, Tozzini R. Estimation of bone turnover in climateric women by the whole body retention of fluoride. Maturitas 1991, 14:57 64.
10. Rigalli A, Ballina JC, Beinlich A, Alloatti R, Puche RC. Pharmacokinetics differences between sodium fluoride and sodium monofluorphosphate and comparative bone mass increasing activity of both compounds, in the rat. Arzneimittelforschung 1994, 44:762 766.
11. Rigalli A, Cabrerizo M, Beinlich A, Puche RC. Gastric and intestinal absorption of monofluorphosphate and fluoride in the rat. Arzneimittelforschung 1994, 44:651 655.
12. Rigalli A, Morosano M, Puche RC. Bioavailability of fluoride administered as sodium fluoride or sodium monofluorophosphate to human volunteers. Arzneimittelforschung 1996, 46:531-533.
13. Stewart J. Conceptos y contextos. International Thomson Editores. México. 1999.
14. Edwards CH, Penney DE. Ecuaciones diferenciales elementales. Prentice- Hall Hispanoamérica. SA. México. 3ra Edición. 1993.
15. Cruichshank S. Mathematics and statistics in anaesthesia. Oxford Medical Press. New York. 1998.
16. Thomas JR, George B. Calculo. Una Variable. Undécima edición. Person Educación. México. 2006
17. Rigalli A, Aguirre C, Armendáriz M, Cassiraga G. Formulación de Modelos Matemáticos de Fenómenos Biológicos. ISBN 950-673-371-6 . Ed de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2003.
18. Rigalli A, Di Loreto V. Manual de Cirugía en la Rata y otras técnicas en medicina experimental. ISBN 950-673-464-X. Ed. de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2005.
19. Canadian Council on animal care Guidelines. Guide to the care and use of experimental animal. Vol 1. Chapter 12. Euthanasia. www.ccac.ca
20. Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LRM. Determinación de la concentración de flúor en muestras biológicas. Ed. de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. ISBN 978-950-673-616-3. 2007
21. Rigalli A, Alloatti R, Puche RC. Measurement of Total and Diffusible Serum Fluoride. J Clin Lab Anal. 1999, 13:151-157.

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11. Efecto del fluoruro sobre el consumo de oxígeno por diferentes órganos en la rata.

Integrantes: Lic. Brenda Fina, Dr. Alfredo Rigalli.

INTRODUCCION

Generalidades
El flúor (F) se encuentra en la naturaleza formando parte de rocas y sales, constituyendo el 0.03% P/P de la corteza terrestre, principalmente como CaF2, Na3AlF6 y NaF [1]. El fluoruro ingresa al organismo de manera crónica, ya sea en forma espontánea o como recurso terapéutico. La forma más común de ingestión de fluoruro es con el agua de bebida, que puede contener desde trazas (10-6 mol/L) hasta 0.15 mol/L [1]. Puede existir exposición a grandes cantidades de F en trabajadores de industrias metalúrgicas, del aluminio, del vidrio o farmacéuticas. Algunos alimentos poseen elevado contenido de flúor, como ciertos peces, el té [2] y vegetales de zonas de suelos ricos en fluoruro (F-) [3].
Como recurso terapéutico se utilizan dosis que oscilan entre 10 y 100 mg de NaF por día, principalmente en el tratamiento de osteoporosis e infrecuentemente en la enfermedad de Paget [4], y en el tratamiento de lesiones óseas por mieloma múltiple [5]. La dosis letal de NaF es de 4 g por vía oral [1].

Efectos tóxicos del fluoruro
La ingestión prolongada de grandes cantidades de fluoruro lleva a un cuadro denominado fluorosis, caracterizado por osteoesclerosis, endo y exostosis, deformaciones óseas [6]. Se han comunicado casos de alteraciones hepáticas [7], dermatitis y urticaria [8,9], diarrea, alteraciones de glándulas salivales, estomatitis y úlceras [9].
El fluoruro es un conocido inhibidor del metabolismo intermedio, especialmente de la glucólisis, por inhibición de la enzima enolasa [10]. Además tiene efecto modulador sobre las proteínas G [11]. Estos efectos sobre el metabolismo se observan con dosis de F- 1000 veces mayores que las que se pueden encontrar en pacientes sujetos a tratamiento crónico.
El fluoruro en concentraciones compatibles con las halladas en personas que residen en áreas con agua de consumo con alto contenido de flúor o reciben sales con flúor por el tratamiento de osteoporosis, produce disminución de la secreción de insulina [12,13,14,15]. Este efecto fue corroborado por estudios en zonas de fluorosis por investigaciones de este mismo laboratorio [16] y de otros centros de investigación [17].
También ha sido demostrado que el F- produce inhibición de su propio transporte y absorción a nivel del intestino, fenómeno que es acompañado de una disminución del consumo de oxígeno por la mucosa intestinal. Este efecto es observable con concentraciones de F- de 10-80 mmoles/L, concentraciones que pueden hallarse en la luz intestinal luego de una dosis terapéutica [18]. En estas condiciones el consumo de oxígeno se ajustó a una función exponencial de la concentración de fluoruro en la luz intestinal:  Vo2=0.67mmolO2min-1gr-1. e-0.109[F] + 0.45 mmolO2min-1gr-1. Sin embargo no existe evidencia experimental que este efecto sobre el consumo de oxigeno pueda producirse en los tejidos con las concentraciones halladas in vivo.
En la actualidad es abundante la información que existe sobre los efectos del fluoruro sobre la producción de especies reactivas del oxígeno y las enzimas involucradas en el metabolismo de las mismas. Es poco el conocimiento que existe sobre el consumo de oxigeno a concentraciones compatibles con las halladas en plasma y tejidos de animales y humanos expuestos a dosis terapéuticas de fluoruro o a ingesta de aguas o alimentos fluorados.
Algunos trabajos realizados en peces han demostrado aumento del consumo de oxígeno, cuando estos se mantienen en agua con fluoruro de sodio (10 ppm) y cloruro mercúrico [19], mientras que el consumo de oxígeno decrece cuando solo se encuentran en fluoruro de sodio [20].
Por otra parte el fluoruro es capaz de unirse a protones y  atravesar la membrana mitocondrial inhibiendo la enzima succinato deshidrogenasa (II) y la citocromo oxidasa (IV) [21,22]. En el caso de la succinato deshidrogenasa se trata de una inhibición mixta [23,24].
Los efectos del fluoracetato sobre el funcionamiento del ciclo de Krebs [25]) no se deben al fluoruro sino a la inhibición por formación de fluorcitrato e inhibición de la enzima aconitato hidratasa
También se ha demostrado unión del fluoruro a grupos hemo férrico y al hemo b595 oxidado de Escherichia coli [26].
Se ha descripto efecto sobre la ATPasa [27] de bacterias donde actuaría disipando el gradiente de protones por formación de HF.  También tiene efecto inhibitorio sobre F1F0 de la ATPasa, que es dependiente de aluminio, por la formación de un complejo: ADP-Al-F-3.
En plantas se observó disminución de la actividad de ATP con bajas concentraciones de fluoruro (0.4m/g/m-3). Efecto que se invirtió luego de 28 días  [28]. En músculo, el flúor en presencia  de Mg2+ y el MgADP forman un complejo que atrapa el sitio activo de S1 e inhibe la ATPase de la miosina [29].

Objetivo general
Estudiar el efecto del fluoruro sobre el consumo de oxigeno en diferentes órganos y tejidos de la rata.

Objetivos específicos
1. Puesta a punto de la metodología para la medición de consumo de oxigeno
2. Medir in vitro el consumo de oxígeno por cortes de hígado, riñón y músculo de ratas expuestos a diferentes concentraciones de fluoruro (0-100 μmol/L)
3. Medir el consumo de oxigeno por cortes de hígado, riñón y músculo de ratas que reciben un tratamiento farmacológico con NaF.

Materiales y Métodos
Se utilizarán ratas Sprague-Dawley adultas del bioterio de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNRosario. El sexo será elegido en el momento de realizar los experimentos en función de la disponibilidad de animales. En el caso que los experimentos los permitan se utilizarán animales que han sido utilizados en otros experimentos y cuyos tratamientos no interfieran con los efectos en estudio en este trabajo.
Luego de la eutanasia, se obtendrán muestras de hígado, riñón y músculo sobre los que se realizarán mediciones del consumo de oxígeno. Los tejidos serán cortados en pequeñas piezas y se medirá el consumo de oxígeno en soluciones de diferentes concentraciones de fluoruro de sodio (0-100 μmol/l).
Las mediciones se realizarán sobre tejidos de animales sin exposición al fluoruro y en animales que consumen aguas con NaF (5 ppm).
Al finalizar el experimento los cortes se fijarán en formol y se procesarán para observación microscópica. Se cuenta con el asesoramiento de la médica patóloga Stella M. Roma, miembro del  Laboratorio de Biología ósea.
Luego de las mediciones de consumo de oxígeno se medirá la concentración de fluoruro en los tejidos y las soluciones.

Preparación de soluciones
Se prepararán soluciones de fluoruro de 0 a 100 μmol/L a partir de NaF de calidad analítica.

Determinaciones de la concentración de fluoruro
En soluciones: se realizará por potenciometría directa utilizando un electrodo de ión específico Orion 94-04 acoplado a un electrodo de referencia de Ag/AgCl [30]
En plasma y tejido: se determinara por potenciometría directa luego de la destilación isotérmica del fluoruro de las muestras por tratamiento de las mismas con ácido sulfúrico a 60°C y recuperación del HF en una trampa alcalina de NaOH [37]

Determinación del consumo de oxigeno por cortes de tejido
La medición del consumo de oxigeno se llevara a cabo utilizando un electrodo de Clark [31].

Eutanasia de los animales
Los tejidos sobre los que se medirá el consumo de oxígeno se obtendrá luego de practicar eutanasia a animales de experimentación. Cuando se lo requiera los animales serán sacrificados por una inyección intracardíaca de 0.5 ml de KCl saturado, con el animal en profundo estado de analgesia y anestesia (inhalatoria con éter sulfúrico o inyectable con ketamina y xilazina) [32,33].

Anestesia
Se utilizará anestesia con ketamina 50 mg/ml y xilazina 2% P/V [33]. Preanestesia, inyección subcutánea de una mezcla de 0.06 ml de xilazina y 0.06 ml de ketamina por cada 100 g de peso corporal. Luego de lograr una sedación y narcosis adecuada, el animal recibirá 0.06 ml de ketamina por vía intramuscular por cada g de peso corporal. 

Obtención de tejidos
Los tejidos se obtendrán con tijera iris y bisturí. Luego de la obtención serán colocados en buffer Krebs Ringer (142 mM NaCl, 5.5 mM KCl, 1.4 mM KH2PO4, 1.4 mM MgSO4, 3.1 mM CaCl2, gaseado con carbógeno y ajustado a pH 7,4)  a 4° C. Se cortarán en trozos no mayores de 2 mm con tijera iris y se utilizarán inmediatamente para la medida del consumo de oxigeno.

Incubación de tejidos
Los tejidos se incubarán en buffer Krebs Ringer, con gaseo constante con carbógeno (95% oxígeno, 5% dióxido de carbono) y ajustado a pH 7,4. Las drogas utilizadas son todas de calidad analítica.

Procesamiento de las muestras para histología
Los tejidos serán fijados en formol buffer, incluidos en parafina y cortados a 6 μm con micrótomo. Se realizará tinción con hematoxilina-eosina y observados al microscopio óptico con el fin de detectar cambios histopatológicos.

Referencias
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19. T. Chitra, N. Parwathy and J. V. Ramana Rao. Effect of NaF and Mercuric Chloride on the Unit Oxygen Consumption of Channa Punctatus.  Fluoride vol 16 Nº 4. 1983
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22. Z. Machoy. Effect of Fluoride Compounds on Respiratory Enzymes. Fluoride Vol 18 Nº 4. 1985 (Abstracts)
23. E. Stachowska. The effect of Fluoride ion on the Activity of Succinato Deshidrogenasa isolated from the pig´s renal cortex. 1997
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33. Rigalli A. Di Loreto V. Experimental Surgical Models in the Laboratory Rat Taylor and Francis Group. CRC Press. Boca Ratón. USA.. In press

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12. Efecto del tratamiento con MFP y NaF sobre el proceso de reparación ósea en ratas

Integrantes: Bioq. Sandra Patricia Mejía Delgado, Dr. Alfredo Rigalli.

Doctorado en Ciencias Biomédicas. Facultad de Medicina. Instituto Italiano de Rosario.

El problema
Los defectos críticos óseos por trauma presentan alteraciones morfofuncionales para su reparación en tiempo y reorganización tisular y generan cambios morfológicos, metabólicos y biomecánicos por no contar con el componente celular y mineral óptimo para una buena y rápida reparación debido a la gran pérdida tisular local.  Estos cambios conducen a la disfunción del miembro afectado, dejando a una gran cantidad de personas con serias consecuencias en su movilidad y funcionalidad.

Hipótesis
Se ha demostrado que el MFP y el NaF producen un aumento del tejido óseo trabecular en ratas normales evidenciado a través de un aumento del número de trabéculas y de su grosor. Además el MFP tendría un efecto adicional aumentando el hueso cortical. La biodisponibilidad de flúor del MFP es el doble de la NaF, por lo que se plantea la hipótesis que la reparación de un defecto óseo en presencia de ambas sales sería mayor que en animales controles y que el efecto podría ser más rápido aún en animales tratados con MFP. Aún con las ventajas mencionadas, la calidad del hueso formado no está comprobada

Objetivo General
Determinar el efecto de la administración oral de  MFP y del NaF sobre el proceso de  reparación ósea en la rata.

Objetivos Específicos

1. Evaluar el efecto de la administración de MFP y NaF sobre la velocidad de reparación ósea.
2. Determinar el efecto de la administración de MFP o NaF sobre la calidad del hueso neoformado mediante el análisis histomorfométrico y la microestructura ósea.
3. Evaluar el efecto del tratamiento con MFP y NaF sobre la velocidad del proceso de mineralización relacionado con el estado de remodelación en el sitio de la lesión y en el hueso adyacente, a través de mediciones radiológicas.
4. Evaluar el contenido de Flúor y compuestos químicos que lo contengan en el tejido neoformado y su relación con la velocidad de reparación y la calidad.

Introducción
El tejido óseo es uno de los sistemas más complejos y amplios del organismo; sus componentes matriciales, minerales y las células hacen de éste un “megacampo” de interacción entre los elementos orgánicos e inorgánicos que le proveen compleja funcionalidad. Su integración con otros tejidos como son el sanguíneo, el muscular  y algunos conectivos blandos le confieren propiedades para el soporte y el movimiento.  El tejido óseo tiene un importante rol en la preservación y funcionalidad de la médula ósea y cumple además relevantes funciones en procesos hematopoyéticos y de diferenciación celular durante fenómenos fisiopatológicos y de reparación. 

Como tejido conjuntivo especializado se caracteriza por tener una matriz extracelular mineralizada que lo distingue de otros tejidos conectivos que también producen matriz. Posee uno de los minerales más abundantes, el fosfato de calcio en la forma de cristales de hidroxiapatita [Ca10 (PO4)6 (OH)2]. Tanto el calcio como el fosfato pueden ser movilizados de la matriz ósea y captados por la sangre según sea necesario para mantener las concentraciones adecuadas en todo el organismo, por lo que se considera el gran reservorio mineral que mantiene al organismo en un “equilibrio” fisiológico al proveer la liberación de iones tan importantes como el Calcio (Ca) y el almacenamiento de otros como la hidroxiapatita, el flúor y el fosfato para ser utilizados según las necesidades metabólicas.

La matriz ósea contiene colágeno de tipo I y en menor cantidad colágeno tipo V. Estos colágenos constituyen alrededor del 90% de la matriz, la cual también contiene sustancia fundamental en la forma de glucosaminoglucanos (hialuronano, condroitinsulfato y queratansulfato), pequeñas glucoproteínas (osteocalcina, osteonectina y osteopontina) y varias sialoproteínas. Las glucoproteínas y las sialoproteínas de la sustancia fundamental desempeñan un papel trascendental durante el proceso de mineralización. Tanto el colágeno como los componentes de la sustancia fundamental se mineralizan para formar el tejido óseo (9).

El calcio y el fosfato son dos iones utilizados en la formación del cristal de hidroxiapatita, responsable de la calcificación del hueso (1). Por su parte, el Fluoruro puede ser intercambiado con otras estructuras del cristal y tiene la propiedad de producir inhibición de una fosfatasa ácida del osteoblasto (célula productora de hueso), involucrada en la transmisión de señales mediadas por factores de crecimiento y receptores de tirosin kinasa. La acción del fluoruro produciría un aumento de la vida media de los intermediarios fosforilados de las cascadas de señalización mediadas por las kinasas ERK, y se ha demostrado que dicha acción produce un aumento de la masa ósea (7).

La presente investigación tiene como finalidad determinar el efecto del Monofluorofosfato (MFP) y del Fluoruro de Sodio (NaF)  en el fenómeno de la reparación ósea y la calidad del hueso neoformado en tibias de rata en un defecto óseo no crítico inducido, evaluando su acción sobre la función osteoblástica, la osteosíntesis y la velocidad en la reparación del defecto.

Se trata de un modelo experimental en ratas Sprague-Dawley que pretende demostrar que la administración oral de MFP y NaF a dos grupos en estudio y bajo óptimas condiciones de los animales, la biodisponibilidad de flúor procedente de estos dos compuestos será suficiente para lograr una arquitectura ósea en la reparación de defectos no críticos y un tejido metabolicamente activo similar al de origen. La técnicas de potenciometría, espectrofotometría, histología, histomorfometría y determinación de la masa ósea, serán utilizadas para medición e interpretación de resultados.

Justificación
Este estudio de tipo experimental controlado está motivado por las diferentes revisiones críticas realizadas tanto en Ortopedia como en Odontología sobre mecanismos de reparación de defectos óseos y entre las que se encuentran las de Esposito (2) Aghaloo (3); y Gielkens (4). Sus revisiones debaten la confiabilidad científica de los procedimientos realizados para aumento óseo, sugiriendo que hace falta más estudios clínicos de tipo aleatorios para su validación (3).   Asimismo, no existe información sobre el efecto del Monofluorofosfato (MFP)  y/o del Fluoruro de Sodio (NaF) en la reparación de lesiones o defectos óseos en animales de experimentación.  Previas investigaciones han sido enfocadas a los estudios metabólicos en animales sanos, especialmente en ratas en crecimiento y en las cuales se indican que tanto el tratamiento con NaF o MFP podría aumentar la masa ósea, estimulando la formación (10).    

La amplia población afectada por diversas lesiones óseas que requieren de reparación intrínseca al tejido, sufre las limitaciones en su calidad de vida en cuanto a movilidad y salud oral entre otros.  En la recuperación del tejido óseo postrauma es necesario el mejoramiento en el volumen y densidad ósea en el sitio de la lesión para proveer firmeza, estabilidad y funcionalidad procurando además que perduren en el tiempo.

“El déficit de hueso en determinadas zonas  del esqueleto supone un mayor problema que en otras zonas (vértebras, fémur, radio, entre otros). Así, la pérdida de gran cantidad de tejido óseo tanto en extremidades superiores como inferiores, constituye una problemática actual que limita la funcionalidad propia del tejido óseo cuando no logra la reestructuración histológica y fisiológica necesaria. Los elementos esenciales para la reparación de este tipo de lesiones son en primer lugar, la presencia de osteoblastos y factores osteogénicos; en segundo lugar, un andamiaje que garantice las  características de osteoinducción y osteoconducción. Por último, un nuevo suplemento sanguíneo, que probablemente sea el factor limitante en estas lesiones” (8).

La participación de este tejido en tan diversas funciones debe estar soportada por el buen desarrollo y calidad de la masa ósea y de su propia microestructura las cuales están condicionadas por el depósito de colágeno, el remodelado, el recambio, la interacción e integración con el microambiente extracelular y el almacenamiento de minerales que le confieren la dureza única a este tejido. Cualquier alteración de una o más de estas funciones y/o estructuras inducen a un desequilibrio que a su vez puede terminar en un rompimiento tisular cuya reparación dependerá de las óptimas condiciones del propio sistema y de la biodisponibilidad de minerales circulantes o almacenados previamente para recuperar el defecto óseo lo mejor posible y en el menor tiempo.

Ante el problema del déficit óseo en áreas en las que se requiere restaurar una superficie se deben potenciar tres funciones básicas: osteoconducción, (crecimiento óseo por aposición sobre una superficie; osteoinducción (estimulación de células pluripotenciales indiferenciadas que estimulan el desarrollo de células formadoras de estirpe ósea; y, osteogénesis (crecimiento óseo por células procedentes del injerto(5), y en esta búsqueda se ha empleado gran variedad de sustitutos óseos y mecanismos de estimulación celular, ante la imposibilidad de la respuesta innata del tejido y en aras de inducir un aumento óseo local. El hueso comprometido deberá recuperar su arquitectura, su celularidad y procurar un aumento óseo en defectos o atrofia ósea; así mismo, mejorar la cicatrización; inducir la migración celular y mejorar los resultados de los injertos óseos, entre otros (6).
En 1974, Shenk describió por primera vez la histología de la Reparación Ósea Primaria (ROP); el fenómeno al que fue atribuido es caracterizado por una serie de acontecimientos que son identificados por cuadros histológicos que son patognomónicos de susodicha reparación y que es observable entre otros, en las fracturas de los huesos largos…”  Según Shenk, este fenómeno inicia con la aparición de una trama vascular activada por factores de crecimiento contenidos en las plaquetas, y por una capa de células osteoblásticas sobre las paredes del defecto (13).
En 1978, Mc Kibbin, describe la biología de la reparación de los huesos largos y define la ‘Activación del callo primario”, como la activación de las células dormidas del periostio que ocurre como consecuencia de traumas, a veces mínimos, al hueso (10).

Actualmente, existe aún debate sobre los métodos para la reparación de defectos óseos críticos y no críticos, entendiendo estos como: Defecto Crítico, aquel que carece de la capacidad de regeneración espontánea. Defecto No Crítico, aquel que sí la tiene.  Al respecto se han publicado innumerables trabajos en los cuales se han utilizado no sólo sustitutos óseos sino también hueso autólogo, lo que predispone al tejido a una reabsorción obligada y al individuo a una morbilidad concomitante desencadenada por la extracción del hueso autólogo (11).

El hueso que llena cavidades lo hace de manera más lenta y tiene una disposición más ordenada donde los haces de colágena están paralelos entre sí constituyendo las osteonas como unidad estructural y funcional del hueso cortical. La vascularización y las características histológicas que rodean la lesión serán fundamentales para su recuperación (12).

Algunas investigaciones se refieren a los procesos de regeneración ósea sin haber un consenso entre los distintos autores de las mismas:

1. “Se consideraba que las ventajas que aporta la regeneración con hueso autólogo o biomateriales eran las más rápidas y completas…para una rehabilitación más precoz y más exitosa… y minimizaba el riesgo de fracturas”
2. La idea que subyace en la literatura es que la presencia del injerto a base del hueso del propio paciente o un sustituto óseo, no sólo refuerza biomecánicamente el hueso sino que además acelera la velocidad de regeneración.

“Ambas conclusiones son falsas; sabemos que las células del injerto autólogo mueren cuando están a más de 100 micrómetros de una fuente vascular (se calcula que se necrosa el 95% de los osteoblastos del injerto) transformándose en tejido no vital y lo mismo ocurre con el sustituto óseo. Ambos materiales deben ser, en primer lugar reabsorbidos para luego aponer nuevo hueso y este proceso de reabsorción de tejido no vital para la posterior aposición del hueso neoformado no supone ninguna ventaja biomecánica y lógicamente retraza mucho el periodo de regeneración”...“Según Glowacki, al utilizar biomateriales en defectos no críticos sólo se está demostrando la osteo-compatibilidad de esos materiales y no la osteoinducción” (11).

Estas afirmaciones también han motivado este estudio, pues si se conoce que los defectos no críticos se pueden regenerar espontáneamente por sí mismos bajo condiciones adecuadas, estaría bien pensar que una “ayuda” mineral que aumente la biodisponibilidad del fluoruro (en este caso), sería de mayor efectividad en el aumento de la masa ósea y obviamente del depósito de minerales sobre ella, lo que sí garantizaría una arquitectura normal y resistente y probablemente una velocidad mayor en la reparación.

Marco teórico
El flúor (F) se encuentra en la naturaleza y constituye aproximadamente el 0.03% P/P de la corteza terrestre. El F ingresa al organismo de manera crónica, ya sea en forma espontánea o como recurso terapéutico. La forma más común de ingestión de fluoruro es con el agua de bebida. El contenido de F en el agua es muy amplio pudiendo variar desde valores menores a 10-6 mol/L y alcanzar hasta 0.15 mol/L(14). Puede existir exposición a grandes cantidades de F en trabajadores de industrias metalúrgicas, del

aluminio, del vidrio o farmacéuticas. Algunos alimentos poseen elevado contenido de flúor, como ciertos peces, el té(15) y vegetales de zonas con suelos con alto contenido de F(16). Si bien existe un gran número de efectos adversos, la dosis letal de NaF es de 4 g por vía oral. El F se utiliza en terapéutica siendo las drogas más utilizadas el fluoruro de sodio (NaF)(17,18,19) y el monofluorofosfato de sodio (MFP)(20,21).

El fluoruro (F-)  es un mitógeno de las células óseas, que produce incremento de la masa ósea. Su metabolismo ha sido ampliamente investigado y actualmente existe un sólido conocimiento sobre el mismo. El mecanismo de acción sobre el osteoblasto es parcialmente conocido, y la  hipótesis con mayor sustento experimental se basa en su actividad inhibitoria sobre la tirosin fosfatasa ácida del osteoblasto(22,23) encargada de desfosforilar proteínas involucradas en la transducción de señales. También existe evidencia que la acción podría ser llevada a cabo por mecanismos que involucran a las proteínas G triméricas asociadas a adenil ciclasa y fosfolipasa C(24,25). En ambos casos el fluoruro prolongaría el efecto de factores de crecimientos sobre las células involucradas.

Los parámetros farmacocinéticos del MFP son diferentes de los obtenidos para el NaF(26,27). A igualdad de dosis de F, el hueso de ratas tratadas con MFP presenta un contenido de flúor óseo superior al de las ratas tratadas con NaF. Hallazgos más recientes demostraron que el mayor contenido de flúor óseo no se debe al ión fluoruro sino a proteínas con flúor ligado por enlaces resistentes a los ácidos(28,29). La biodisponibilidad de flúor cuando se administra MFP es el doble de la biodisponibilidad de flúor si se utiliza NaF en dosis equimolares. Al administrar NaF en plasma se encuentra al anión fluoruro como especie predominante. En cambio, luego de la administración oral de una dosis de MFP, además del anión, se encuentra en plasma una fracción de flúor ligado a proteínas. Hemos demostrado que el flúor ligado a proteínas se origina en el plasma como consecuencia de una pequeña fracción que se absorbe en el estómago sin sufrir hidrólisis y se liga a las Alfa Macroglubulinas (AM). La fracción de proteínas con flúor ligado también se encuentra presente en el plasma de seres humanos tratados con MFP(30).  

Las Alfa-Macroglobulinas (AM) son antiproteasas del plasma a las que se liga el  MFP. Estas proteínas pierden su actividad biológica cuando se ligan al MFP in vitro e in vivo(31).   La absorción de MFP y la formación del complejo AM-MFP se encuentra aumentada en ratas tratadas con MFP y calcio, situación en la que aumenta la absorción intestinal del MFP debido a inhibición de la enzima fosfatasa alcalina (32).  El complejo AM-MFP es biológicamente activo con respecto al metabolismo óseo, debido a que su catabolismo genera fluoruro iónico que vuelve al espacio extracelular. En sujetos tratados crónicamente con MFP, luego de 10 hs de una dosis de MFP, sólo se encuentra elevada la fracción de flúor ligada a las proteínas (33). 

Una ventaja adicional del MFP es que la fracción de F ligada a las proteínas no produce efectos adversos que si produce el NaF (34,35,36,37)

Trabajos publicados por el laboratorio donde se desarrollará este proyecto indican que el complejo AM-MFP es captado in vivo e in vitro por receptores presentes en hígado y hueso de rata. Posteriormente, ambos tejidos liberan péptido/s de peso molecular 2200±600 Da (38)  En plasma de pacientes tratados con MFP se encuentran péptidos de peso molecular similar(63). Dado que estos péptidos se encuentran solo en el tratamiento con MFP se sospecha que los mismos podrían deberse al metabolismo del complejo y que quedan retenidos en la matriz ósea en el proceso de modelación y remodelación del tejido calcificado(39).
Además de péptidos con flúor de peso similar al de las especies obtenidas in Vivo, se encuentran otros péptidos de mayor peso molecular con flúor ligado por un enlace resistente a la hidrólisis ácida. Al suspender el tratamiento en ratas en crecimiento, estos péptidos disminuyen su concentración aumentando los péptidos de menor peso molecular y el fluoruro ligado a la fluorapatita, no produciéndose modificación del contenido total de fluoruro. Se postula que estas transformaciones producirían un aumento local de la concentración de fluoruro, lo que estaría actuando como estímulo del crecimiento óseo (41).

El modelado y el remodelado óseo son dos procesos básicos del esqueleto por el cual el tejido óseo crece, repara sus microdaños y se renueva. Ambos procesos son llevados a cabo por la acción de osteoblastos y osteoclastos, células que se originan a partir de precursores del mesénquima y de la médula ósea, respectivamente. El control de las células y su proliferación a partir de precursores son determinantes sobre la masa ósea. La diferenciación y proliferación de osteoblastos a partir de células pluripotentes del estroma de la médula ósea involucra a las cascadas de señalización del sistema Wnt/beta-catenin. Los precursores de osteoblastos poseen expresión del receptor LRP en sus isoformas LRP5 y LRP6, receptores de las proteínas Wnt (40). Algunas isoformas del receptor LRP reconoce a la AM luego de su inactivación, proceso que puede ser llevado a cabo por la unión a proteinasas o a moléculas como el MFP.  El complejo AM-MFP como los péptidos son captados por el tejido óseo, indicando que los receptores de estos tejidos podrían reconocer el complejo AM-MFP.
 
El efecto del MFP sobre el hueso podría en parte, atribuirse al fluoruro liberado por su hidrólisis. Sin embargo el mecanismo no parece ser igual al ejercido por el fluoruro, ya que al suspender el tratamiento la masa ósea de los animales se mantiene elevada, respecto de los controles y los animales tratados con NaF, en los que la masa ósea se asemeja a los controles luego de 30 días(41). Los resultados mencionados sugieren una posible interacción del complejo AM-MFP con el receptor LRP5/6 de precursores osteoblásticos. Esta interacción podría aumentar la afinidad entre LRP5/6 y el receptor Frizzled; disminuir la acción de proteínas inhibidoras del receptor LRP5/6 como son las proteínas Dkk y Esclerostin o la relación del receptor LRP con el co-receptor Kremen.  En cualquiera de estas situaciones la acción de Wnt sobre los niveles de beta-catenina no fosforilada serían mayores.

Materiales y Métodos

Animales de experimentación
Para llevar a cabo esta investigación, se utilizarán ratas de la línea Spague Dawley de 7 semanas. El sexo no será determinante y se decidirá el mismo al inicio de los experimentos y las disponibilidades del bioterio proveedor de animales. Los animales se manipularán de acuerdo a las normas vigentes de cuidado y tratamiento de animales de experimentación(42,43).
Trabajos de bioterio
Los animales se alojarán en jaulas colectivas (hasta 5 animales por jaula) o individuales, según el experimento. Con acceso a agua y alimento ad libitum. El bioterio tiene control
de temperatura automático 22-26°C, circulación y filtrado de aire programado. La limpieza y controles será realizado a las 8.00 AM y a las 5.00 PM por personal idóneo.
Anestesia
Se realizará preanestesia por inyección subcutánea de una mezcla de 1,2mg de  Xilazina/100g peso corporal y 3mg ketamina/100g de peso corporal. Luego de alcanzado un grado adecuado de narcosis y sedación se inyectarán por vía intramuscular clorhidrato de lidocaína y 5 minutos después en el mismo sitio se inyectarán 3mg Ketamina /100 de peso corporal (44).
Analgesia
Antes o después de la cirugía o procedimiento experimental potencialmente doloroso para el animal se inyectará por vía subcutánea 2.5 mg diclofenac/100 g de peso corporal. Se evaluará el dolor a través del estado de movilidad, agresividad y reacción al contacto y se repetirá la dosis a intervalos requeridos (45).
Antibioticoterapia
 En el caso que se realicen intervenciones quirúrgicas se realizará antibioticoterapia con ceftriaxona, realizando la inyección intramuscular de 3 mg del antibiótico/100 de peso corporal disuelto en 0.1 ml de solución fisiológica estéril. La inyección se realizará 30 minutos antes de la cirugía (46).
Eutanasia.
Se realizará sometiendo en primer término al animal a anestesia inhalatoria con éter sulfúrico, hasta obtener una profunda anestesia y analgesia. Luego se realizará una
inyección intracardiaca de KCl saturado que produce un paro cardiorespiratorio instantáneo(47).
Cirugías
Se llevarán a cabo en un quirófano con material estéril, el que se logrará por esterilización en estufa a 140°C durante 3hs (material de acero inoxidable) y en autoclave 30 minutos a 120°C. El cirujano y asistentes utilizarán vestimenta descartable y las condiciones de asepsia adecuada.
Se rasurará la zona a incidir en las patas traseras del animal. Previa asepsia del campo quirúrgico con iodopovidona, se realizará con bisturí hoja Nº 15 una incisión  longitudinal en ambas tibias y se decolará la fascia hasta llegar a exponer el hueso. Con una fresa número 6 y a rotación manual para no producir necrosis ósea,  se realizará una cavidad en la parte plana de cada tibia hasta llegar al hueso medular. Dicha cavidad no será rellenada con ningún material y sólo será reparada por su propio coágulo. Luego de realizada las intervención quirúrgica, se recolocarán  los planos en posición y se suturará la herida con hilo reabsorbible.
Los animales serán sacrificados a los 30 días según normas vigentes de cuidado y tratamiento de animales de experimentación (42,43). Se diseccionarán las tibias intervenidas, las cuales serán procesadas para desmineralización en EDTA al 10%      pH 7.0; una vez lograda la desmineralización, los especimenes anatómicos serán procesados para la interpretación histológica con la técnica de Hematoxilina-Eosina.
Histomorfometría ósea
El tejido obtenido se fijará en formol al 10% a pH=7, y se procesará de la siguiente manera: inclusión en parafina, cortes a 4-6 micras con un micrótomo (Minot-Mikrotm Typ 1212-Leitz-Wetzlar-Germany), colado de los cortes sobre portaobjeto con albúmina glicerinada de Mayer, tinción con hematoxilina-eosina y finalmente se realizará el montaje con Bálsamo de Canadá y colocación de un cubreobjetos. Los preparados histológicos obtenidos se analizarán empleando un microscopio (Olympus, Zeizz, West Germany) con cámara digital de 8.5 Mpx. OLYMPUS S-350.
Se realizará histomorfometría estática. En los preparados histológicos se medirán los siguientes parámetros:
Área total de tejido analizado (TV) (tejido óseo + médula ósea = TV)
Área ocupada por hueso (BV)
Perímetro del área (BS)
Con estos valores se calculará:
1- Porcentaje de Hueso Trabecular = BV/TV (%)
2- Grosor Trabecular: Tb.Th (μm) = [2/(BS/BV)]
3- Número deTtrabéculas: Tb.N (1/mm) = [(BV/TV)/(Tb.Th)]
4- Separación Trabecular: Tb.Sp (μm) = [(1/Tb.N)-Tb.Th].
5 -Porcentaje de superficie ósea cubierta por osteoblastos.
6 -Porcentaje de superficie ósea cubierta por osteoclastos.
Las medidas mencionadas se realizarán sobre imágenes digitalizadas utilizando el Software ImageJ (de uso libre del NIH)
Protocolo para medición radiológica
La medida de densidad mineral se realizará por análisis de las radiografías de la tibia simultáneamente, con un patrón conteniendo 10, 20, 30 y 44 mg Ca/cm2. Las mediciones se realizarán con un software específico (ImageJ) utilizando imágenes digitales de las radiografías obtenidas con un equipo de rayos X de 70KV (48).
Medición de la remodelación ósea por captación de fluoruro
La formación y resorción ósea se determinará aplicando un modelo matemático que utiliza los valores de fluoruria durante 24hs antes y 24hs después de la administración de 1 umol de NaF por vía endovenosa/100 g de peso corporal y los valores de fluoremia  medidos en plasma obtenido antes de la dosis de NaF y 3, 18 y 33 minutos luego de la misma(49). Los valores de remodelación ósea se expresarán en µmol/l.min.
Administración del NaF y del MFP
El NaF o MFP se administrará por vía oral. La dosis utilizada será de 80 µmol de F en una solución 80 mM de NaF o MFP. Se utilizarán dispensadores de para la solución con medidores del volumen gastado por ingesta del animal.

Determinaciones bioquímicas
Determinación de la concentración de flúor plasmático
La medición de la concentración de flúor plasmático se realizará por potenciometría directa utilizando un electrodo de ión específico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analógico digital. La determinación
se basa en la relación lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentración de flúor en las muestras o patrones utilizados.
Previo a la determinación potenciométrica, el flúor será aislado de las muestras por microdifusión isotérmica, tratando la muestra con ácido sulfúrico 3M durante 7 días a 60 °C y recuperando el ácido fluorhídrico desprendido de la muestra sobre NaOH sólido depositado en la tapa de la cámara de destilación. Luego de la destilación isotérmica, la trampa de NaOH se ajusta a pH 5-5.5 con ácido acético y a un volumen final de 60 µl.  Este procedimiento requiere muestras de plasma o suero de 20-100µl y simultáneamente con las muestras se procesan testigos de NaF de concentraciones 10-3 M - 10-6 M (50).
Determinación de flúor en hueso
El material ósea será secado a 60°C, hasta peso constante, valor que se obtendrá con una balanza Mettler sensibilidad 0,01 mg. Luego la muestra es calcinada a 550 °C durante   6 hs hasta la eliminación total de materia orgánica. Las cenizas serán reducidas a polvo con la ayuda de un mortero y se determinará la concentración de flúor por destilación isotérmica de una alícuota de las cenizas. Los resultados se expresarán en µmoles/g de hueso seco (50).
Determinación de la concentración de flúor urinario
La medición de la concentración de fluoruro en orina realizará por potenciometría directa utilizando un electrodo de ión específico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analógico digital. La determinación se basa en la relación lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentración de flúor en las muestras o patrones utilizados. Simultáneamente con las muestras se procesan soluciones patrones de NaF de  10-3 M - 10-6 M (50). A las muestras y las soluciones patrón se les adicionaraa buffer 1:10 (ácido acético/acetato de sodio 2M) para ajustar pH a 5-5.5 y homogeneizar la fuerza iónica de las soluciones. La técnica requiere muestras de orina de 50 µl o más.
Determinación de calcio sérico
La calcemia se determinará con un equipo  comercial CaColor AA (Wiener Lab. Rosario). El método se fundamenta en la reacción del calcio con o-cresolftaleina complexona a pH 10.8, dando un complejo de color magenta que se mide espectrofotométricamente a 570 nm. La determinación utiliza 5-15 µl de muestra y simultáneamente se construye una curva de calibración utilizando una solución patrón de 10 mg Ca/dl. La medición de la absorbancia es proporcional a la concentración de calcio en la solución, la que se determinará utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11.

Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizarán comparando más de dos grupos para lo cual se utilzará Analisis de la Variancia a un criterio con post test de Neuman Keuls o test de Kruskal Wallis con post test de Dunns, dependiendo que la distribución sea o no normal. Cuando se comparen dos muestras se harán a través de t de Student para datos independietes o test de Mann Witney, dependiendo de que la distribución de los datos sea o no normal. En todos los casos se consideraran diferencias significativas si p<0,05.

Referencias

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50. Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LR.  Determinación de la concentración de flúor en muestras biológicas. 1° Ed.  Editorial de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2007.

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13. Cooperación Internacional - Proyecto conjunto: Evaluation of insulin signal in muscle and liver in diabetic or not rats after chronic exposure to fluoride.

Integrantes: Lic. Mercedes Lombarte, Lic. Brenda L Fina, Lic. Maela Lupo, Dr. Lucas R Brun, Dr. Alfredo Rigalli.

CONICET
Laboratorio de Biología Ósea.
Facultad de Ciencias Médicas. UNRosario. Santa Fe 3100. Rosario.
Titular del Proyecto parte Argentina: Dr. Alfredo Rigalli.

FAPESP
University of São Paulo - Bauru Dental School.
Street: Al. Dr. Octavio Pinheiro Brisolla, 9-75. Bauru.  Brazil
Titular del proyecto contraparte Brasil: Marília Afonso Rabelo Buzalaf.

Antecedentes
El fluoruro es utilizado con fines terapéuticos en el tratamiento de la osteoporosis [1] y la prevención de caries dentales [2]. Por otra parte la ingesta espontánea de fluoruro en el agua de bebida es la principal vía de ingreso de flúor al organismo. Cuando la concentración de flúor en agua no supera 1,5 mg/l, no se describen efectos adversos, sin embargo por encima de estos valores se presentan diversas alteraciones metabólicas que configuran diferentes cuadros de un estado conocido como fluorosis,que afecta a millones de personas en el mundo. La fluorosis es una complicación que se presenta cuando la ingesta de flúor supera 2 mg/día, alcanzando diversos grados de gravedad, de acuerdo a la dosis diaria. La alteración de la secreción y de la respuesta insulínica ha sido descripta por primera vez y ampliamente estudiada en nuestro laboratorio [3,4,5,6,7,8,9]. La inhibición de la secreción de insulina luego de una dosis terapéutica y la resistencia a la insulina en exposiciones crónicas son los rasgos principales. La exposición crónica al flúor es común en poblaciones que ingieren aguas con contenidos de flúor elevado, como existe en varias regiones de nuestro país [6] y en otros países como la india [10]. Se ha demostrado que la resistencia a la insulina es en parte por la presencia de precursores de insulina con menor efecto a nivel de los tejidos blancos [8] y por otra parte por alteración de la transducción de señales corriente abajo del receptor de insulina [11]. Resultado a nivel proteómio indican alteración de enzimas relacionadas al metabolismo energético a nivel renal [12]. Estudios recientes de nuestro laboratorio indica que la resistencia a la insulina disminuye por la actividad física en ratas con un plan de entrenamiento en cinta ergométrica (datos no publicados).
La interrelación entre el efecto del fluoruro sobre la respuesta insulínica y el metabolismo óseo está muy bien demostrado [4]. En ratas en crecimiento la captación de fluoruro ósea debido al alto recambio óseo asociado al crecimiento permite la normalización del metabolismo glucídico. Sin embargo este fenómeno no ocurre con ratas adultas o con insuficiencia renal, en las que la acumulación de fluoruro en plasma es más importante [9]. Al presente se ha obtenido evidencia que el fluoruro simultáneamente con los efectos mencionados modifica el funcionamiento de la cadena respiratorio y el estrés oxidativo, pudiendo atribuirse en parte a estas modificaciones, las alteraciones óseas observadas en ratas tratadas con fluoruro de sodio [13].
El monofluorofosfato de sodio (MFP) es una droga que genera fluoruro por su metabolización y no presenta los efectos observado en tratamientos crónicos con fluoruro [5,14]. El PIP 2009-2011 adjudicado por CONICET tiene como objetivos profundizar en los efectos óseos y no óseos del MFP.
El trabajo en colaborativo con el laboratorio dirigido por la Dra Buzalaf permitirá complementar los estudios en el área de proteómica, respuesta insulínica, ejercicio físico y consumo de oxígeno en ratas con exposición crónica al fluoruro.

Referencias
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6- de la Sota M, Rigalli A, et al. Medicina (B Aires). 57:417-420.1997
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14- Rigalli A, et al. Arzneimittelforschung. 44(I), 762‑766.1994.

Objetivos a concretar en el laboratorio Argentino:
1- Evaluar la respuesta insulínica en ratas normales y diabéticas con exposición crónica al fluoruro.
2- Evaluar el efecto del ejercicio físico sobre la resistencia a la insulina en ratas tratadas crónicamente con fluoruro.
3- Evaluar las modificaciones del consumo de oxígeno por tejidos de ratas expuestos a tratamiento crónico con fluoruro.

Tareas a realizar:
Análisis proteómico a nivel de musculatura estriada en ratas tratadas con fluoruro (Brasil).
Estudio del estado de fosforilación de IRS en la cascada de señalización de insulina en tejidos blancos (Brasil).
Medida de consumo de oxígeno in vivo e in vitro (Argentina).
Medida de la eficiencia de conversión de alimentos (Argentina).
Medidas de resistencia a la insulina a través de pruebas funcionales: clamp euglicémico hipeinsulínemico, pruebas intravenosa de tolerancia a la insulina y HOMA-IR (Argentina).
Efecto del ejercicio físico controlado en ratas normales y diabéticas con y sin tratamiento con fluoruro enel agua de bebida (Argentina).

Resultados previstos
Las actividades a desarrollar previstas en este proyecto de cooperación arrojarán resultados que permitirán comprender el mecanismo de acción del fluoruro a nivel tisular y contribuirán a prevenir o tratar efectos adversos originados por la fluorosis.

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