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LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN


  1. Efecto de la yerba mate sobre el tejido óseo

  2. Efectos de drogas osteotrópicas sobre cartílago de crecimiento y hueso subcondral de ratas


1. Evaluación del contenido de flúor en aguas de consumo de la provincia de Santa Fe. Relación con la salud dental y el riesgo de fluorosis.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Prof. Mirta Armendariz, Dra. María C. Aguire, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers.

Introducción
El flúor (F) es un elemento de amplia aplicación en salud humana y la industria. En salud se lo emplea para el tratamiento de la osteoporosis y en la prevención de caries dentales (dentífrico, agua de bebida, etc). La utilización de aguas fluoradas es materia de discusión, ya que la ingesta de F por esta vía sumada a otras puede conducir a cuadros de fluorosis. Actualmente la exposición al F proveniente de fuentes naturales está aumentada. La utilización de aguas fluoradas produce ingestas mayores a las previstas ya que todos los alimentos preparados con dicha agua tienden a concentrar F. La utilización de compuestos con F es extensa: como pesticidas, en el pulido de pisos y en la conservación de maderas,  preparación de papeles de embalaje, alfombras y artículos textiles, el teflón, los CFC utilizados en refrigeración, industria del vidrio y del aluminio. Estas industrias generan gran cantidad de productos con F en forma soluble que contaminan suelos y aguas superficiales. Se suman los fertilizantes con fosfato que pueden contener hasta un 5% de F. Es importante tener en cuenta que el fluoruro de sodio es una sal altamente soluble, pudiendo  provocar alta bioacumulación en el agua. Los efectos tóxicos son dosis dependiente y están relacionados fundamentalmente a los niveles que el F alcanza en el plasma y los tejidos. Aun en baja concentraciones  el F interfiere la transducción de señales y afecta el ciclo celular.
Por lo expuesto, es previsible observar un incremento de la exposición al F por parte de la población como así también la aparición de fluorosis y sus complicaciones.
El riesgo de fluorosis no es sólo aplicable a humanos, ya que está demostrado el efecto del F en la disminución de la preñez de bovinos y la disminución del poder germinativo de semillas en suelos con alto contenido de F. El conocimiento del contenido de F en aguas y tierras cuenta con poca y antigua información. El último relevamiento se realizó en la decada de 1940 por OSN en la que no se muestrearon todas las poblaciones y no se dispone de la información certera sobre el tipo de agua estudiada, ni la técnica utilizada para la determinación.
Se ha iniciado un relevamiento del contenido de F en aguas de consumo de la provincia de Santa Fe, gracias al aporte realizado por la secretaria de Ciencias Tecnología e Innovación de la gobernación de la provincia. Se ha obtenido la colaboración de estudiantes de la UNR en el proceso de recolección de muestras y en la actualidad se carece de información de localidades alejadas y con pocos habitantes, pero de gran actividad agropecuaria.

Objetivos
1- Completar la información sobre el contenido de F en aguas y tierras de la provincia de Santa Fe.
2- Obtener información sobre el acceso de las poblaciones a aguas seguras en lo referente al contenido de F.
2- Establecer la ingesta de flúor en las diferentes poblaciones y estimar el riesgo de fluorosis.

Este proyecto permitirá completar un mapa sanitario sobre el contenido de F en aguas y suelos de la provincia de Santa Fe y su relación con las actividades socioeconómicas. Se podrá utilizar la información para sugerir sobre la necesidad de instalación de plantas potabilizadoras por ósmosis inversa y/o sobre el funcionamientode las actuales.
La relación entre los datos que se obtengan de la ejecución de este proyecto y los ya existentes permitirá establecer un pronóstico sobre la evolución del contenido de F en tierras y suelos, con la posibilidad de alertar sobre los niveles críticos del mismo.
Los datos obtenidos no solo serán de utilidad en salud humana sino tambien de aplicación al sector agropecuario.

Materiales y Métodos
En la actualidad se dispone de mediciones de flúor en aguas y tierras, obtenidas a partir de muestras recolectadas por alumnos de la facultad de Ciencias Médicas. Los alumnos han sido instruidos en la toma de muestra de manera de ser las mismas fiables. A pesar del esfuerzo realizado por el equipo del laboratorio en obtener muestras de la provincia, hay poblaciones que han quedado sin muestrear por no existir alumnos proveniente de las mismas. En este proyecto se procurará obtener muestras de dichas poblaciones y completar el mapa sanitario en lo referente al contenido de F y la disponibilidad de aguas de consumo seguras para la población.
* Viajes: están previsto tres viajes: noroeste, noreste y sur de la provincia, obteniendo muestras de agua y tierra, así como información relevante en lo que respecta a actividades socio-económicas (agricultura, industrias) que puedan modificar el contenido de F. Las muestras de agua se obtendrán de la red local de provisión, de pozos, de plantas de ósmosis inversa o de proveedores de aguas potabilizadas y soda. Las muestras se obtendrán en tubos de polietileno al igual que las muestras de suelos.
*  Determinación de F en agua: se realizará con un electrodo de ion específico y voltímetro digital. La determinación de flúor en tierra se realizará con el mismo electrodo previa destilación del flúor por tratamiento con ácido. El laboratorio cuenta con la metodología y equipamiento, optimizada para 100 muestras diarias.
* Obtención de un mapa de distribución de F. Se realizará un mapa detallando la distribución de F en aguas de consumo, aguas de pozos, de plantas de ósmosis inversa, aguas potabilizadas y tierra. Los valores serán correlacionados con los valores obtenidos por OSN hace aproximadamente 70 años. Se evaluará la evolución del contenido de F en los diferentes sectores de la provincia en relación con sus actividades socio-económicas
*Publicación de los resultados: los resultados que devengan de estas investigaciones se analizarán en conjunto con los de un proyecto previo y se pondrán a disposición de los profesionales de la odontología y la medicina. En principio serán publicados en la página web del Laboratorio de Biología Ósea, junto a recomendaciones respecto del consumo de agua y la utilización de la misma. Se presentarán en congresos regionales de profesionales de la medicina, veterinaria y odontología y se publicarán en revistas de acceso a los profesionales del área (Actualizaciones en Osteología y publicaciones de Círculos Odontológicos). Finalmente se intentará llegar a la comunidad profesional a través de la revista Medicina (BAires).
* Se informará a cada población mediante un informe escrito dirigido a los municipios respecto de medidas preventivas (de ser necesario).

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2. Relevamiento y monitoreo del contenido de fluoruro en aguas superficiales y profundas de la provincia de Santa Fe.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Prof. Mirta Armendariz, Dra. María C. Aguire, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación. Gobierno de Santa Fe


Antecedentes
El flúor (F) es un elemento de amplia aplicación en salud humana y la industria.
En salud se lo emplea para el tratamiento de la osteoporosis  y en el tratamiento y la prevención de caries dentales en dentífrico, colutorios, comprimidos y barnices dentales. La utilización de aguas fluoradas es materia de discusión. Los investigadores que sostienen el uso del F como preventivo en la aparición de caries, no desechan la posibilidad de fluorosis.  Actualmente la exposición al F proveniente de fuentes naturales está aumentada. La utilización de aguas fluoradas produce ingestas mayores a las previstas ya que todos los alimentos preparados con dicha agua tienden a concentrar F. La utilización de compuestos con F como pesticidas (fluoraluminato, sulfuril fluoruro y NaF), en el pulido de pisos (fluorsilicato) y en la conservación de maderas (KF)
En la elaboración de productos industriales se utiliza perfluoroctanansulfonil fluoruro en preparación de papeles de embalaje, alfombras y artículos textiles. El Teflón adiciona fluoruro a las comidas. Los cloro fluoro carbonos (CFC) utilizados como líquidos en refrigeración tienen asignados gran rol en la destrucción de la capa de ozono. El CaF2 y MgF2 son utilizados en la industria del vidrio y el espatoflúor en  la obtención de aluminio. Como dato alarmante se puede mencionar que en el primer trimestre del año 2005 se utilizaron 168000 toneladas de espatoflúor. Estas industrias generan gran cantidad de productos con fluoruro en forma soluble que contaminan suelos y aguas superficiales. Muchas industrias generan aerosoles que contienen fluoruro, entre estas se encuentran fundiciones de aluminio y zinc, plantas de enriquecimiento de uranio, fábricas de ladrillos y cerámica.
Los fertilizantes con fosfato pueden contener hasta un 5% de fluoruro. Cuando se utilizan con el fin mencionado se aportan entre 400-1000 g de fluoruro por hectárea que se incorporará a los vegetales de consumo humano  o al ganado que consuman el pastoreo.
Es importante tener en cuenta que el fluoruro de sodio es una sal altamente soluble, pudiendo alcanzar el valor de 1 mol/L, pudiendo provocar alta bioacumulación en el agua.
Los efectos tóxicos son dosis dependiente y están relacionados fundamentalmente a los niveles que el fluoruro alcanza en el plasma y los tejidos. En bajas concentraciones interfiere la transducción de señales y afecta el desarrollo del ciclo celular.
Por lo expuesto, es previsible observar un incremento de la exposición al F por parte de la población como así también la aparición de fluorosis y sus complicaciones.

Objetivo
Obtener un mapa de la concentración de minerales con potencial nocivo para la salud humana y animal en las aguas superficiales y profundas, en relación a las actividades económicas, estableciendo modelos matemáticos predictivos de cambios en la concentración (a largo plazo). En este proyecto y como primer etapa se estudiará el flúor.

Plan de trabajo

Recolección de muestras y actividades socioeconómicas
La recolección de muestras de aguas de la provincia se realizará con la colaboración de estudiantes de la Universidad Nacional de Rosario, oriundos de localidades de la provincia de Santa Fe. Las localidades que serán muestreadas son: Aaron Castellanos, Alberdi, Andino, Armstrong, Arroyo Seco, Cañada de Gómez, Capitán Bermudez, Carcaraña, Carlos, Pellegrini, Casilda, Chañar Ladeado, Colastine Norte, Diego de Alvear, El Trebol, Elisa, Esperanza, Figuiera, Fray Luis Beltran, Funes, Gato Colorado, Granadero Baigorria, Humberto, Las Rosas, Las Toscas, Logroño, Margarita, María Susana, Máximo, Paz, Moises Ville, Murphy, Piamonte, Pilar, Pueblo Ester, Puerto General San Martín, Rafaela, Reconquista, Ricardone, Rufino, San Carlos Centro, San Jorge, San José del Rincón, San Lorenzo, Santa Fe, Santo Tomé, Sastre, Sauce Viejo, Teodolina, Tostado, Venado Tuerto, Vera, Villa Constitución, Villa Gobernador Galvez, Villa MInetti, Virginia.

Las muestras de agua serán obtenidas por los alumnos en tubos de polietileno en un volumen de 1 mL en tres días diferentes. Las muestras serán conservadas a temperatura ambiente y serán procesadas para la determinación de flúor.
De la misma manera cada alumno realizará un relevamiento local de las industrias y actividades económicas de la región, haciendo hincapié en aquellas que producen desechos vertidos a sumideros o aguas superficiales.
Como método de control, un 10% de las poblaciones serán muestreadas directamente por los responsables de este proyecto

Determinación de la concentración de flúor [1]
En una primer etapa se realizará medición de la concentración de fluoruro y de flúor ácido lábil en el agua.

Medida de la concentración de fluoruro
Se realizará por potenciometría directa con un electrodo de ión específico Orion 94-09 y electrodo de referencia de plata/cloruro de plata, con lectura a través de un software específico previa captura de datos y digitalización de los mismos.
Las muestras de agua se estandarizan en fuerza iónica y pH por agregado de un buffer de ajuste en una proporción volumen muestra: volumen buffer = 10:1.
Simultáneamente se procesan soluciones estándar de fluoruro de sodio de concentraciones adecuadas a las muestras. La concentración de fluoruro en el agua se obtiene por obtención de la función de regresión entre los milivoltios desarrollados por los estándares en función del logaritmo de la concentración. Con los parámetros obtenidos de esta regresión se calculará la concentración de fluoruro en el agua, la que se expresará en ppm (partes por millón: mg/litro).
Simultáneamente se procesa una solución control, de concentración de fluoruro desconocida para el operador y las determinaciones son repetidas si la misma no pertenece al intervalo de confianza del 95%.

Medida de la concentración de flúor ácido lábil
Esta determinación permite medir la concentración de flúor que se encuentra formando compuestos poco disociados o ligados por enlaces covalentes sensible al tratamiento con ácidos. El fluoruro en presencia de calcio o fosfato puede formar compuestos que no son detectados por electrodo de ión específico, de la misma manera otros compuestos utilizados en
La determinación requiere la destilación isotérmica del flúor por tratamiento con ácido sulfúrico 6 N a 60 °C. El fluoruro desplazado de los compuestos por el tratamiento ácido es capturado por una solución de NaOH que se encuentra dentro de la misma cámara de destilación. Pasado 6 días de destilación, las cámaras se abren, y las trampas de NaOH se neutralizan con ácido acético glacial en dilución apropiada para obtener un pH final 5-5.5. Se ajusta el volumen de las muestras a un mismo valor final, habitualmente 50-100 ul y finalmente la concentración de fluoruro se mide como se indico en anteriormente.
Simultáneamente se procesan soluciones estándar de concentraciones adecuadas. La concentración de flúor acido lábil se obtiene por diferencia entre la concentración hallada luego de la destilación y la concentración de fluoruro obtenida por medida directa sin destilación. Los resultados se expresarán en ppm.

Análisis multivariado
La concentración de fluoruro y flúor ácido lábil de las muestras de agua de cada localidad o región se correlacionará con las actividades socioeconómicas. La concentración de flúor será considerada como una variable cuantitativa. 
Con respecto a las actividades económicas en un primer estudio se dividirán en: actividades agropecuarias: la que se subdividirá en agricultura y ganadería. Cada una de ellas tendrá un valor que oscilará entre 0 y 100%, de manera complementaria. Las industrias se clasificarán en metalúrgica, alimenticia, curtiembres, procesamiento de papel. Las diferentes actividades económicas de la región se tomarán como variables categóricas con dos niveles (1: si se presenta en la región y 0 si no se realiza).
La información se obtendrá a partir de datos recabados por los alumnos en sus respectivas ciudades y a través de información del ministerio de economía de la provincia de Santa Fe.

Modelos matemáticos
Establecidas las asociaciones entre concentración de fluoruro y flúor ácido lábil, se obtendrá funciones matemáticas que las relacionen. La repetición de las mediciones permitirá establecer la modificación a lo largo del tiempo [2].

Referencias
1. Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LR.  Determinación de la concentración de flúor en muestras biológicas. 1° Ed.  Editorial de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2007. ISBN 978-950-673-616-3
2. Rigalli A, Aguirre C, Armendáriz M, Cassiraga G. Formulación de Modelos Matemáticos de Fenómenos Biológicos. ISBN 950-673-371-6 . 1 ° Ed. 300 ejemplares.  Ed de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina 2003.

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3. Evalución del contenido de flúor en tierras de Santa Fe y su relación con la fluorosis y el crecimiento de cultivos.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Lic. Brenda Fina, Téc. Hilda Moreno, Martín Correa Luna (INTA), Prof. Mirta Armendariz, Dra. María C. Aguire, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación. Gobierno de Santa Fe. 2011

El fluoruro en cantidades mayores a lo recomendado puede conducir en animales a un cuadro clínico de fluorosis, cuadro que tiene su contraparte en vegetales.
La SECTeI subsidió la investigación sobre la distribución de flúor en aguas de Santa Fe. Este estudio concluyó que los valores de flúor en agua de pozo en el 72% de los casos se encuentran dentro de los parámetros aconsejables por OMS. La zona que supera los valores recomendados se ubica en la región sudoeste. En aguas de red, el 96% de los valores medidos se encuentran dentro de los aconsejados por la OMS.
Simultáneamente se obtuvieron muestras de tierras de 57 localidades. Los valores fueron más elevados que en las aguas y se observó mayor acumulación de flúor en tierras rurales, que hace sospechar un enriquecimiento como consecuencia de la actividad agropecuaria. No existen estudios que indiquen valores inocuos de flúor en tierra.
Los compuestos que contienen flúor pueden ser solubles o insolubles, por lo tanto podrían ser modificados por el regímen pluvial y la ubicación de las cuencas hídricas. No se han evaluado las especies químicas bajo las cuales se encuentra el flúor en la tierra, ni la disponibilidad de éste para los vegetales. La industrialización de ciertas zonas puede producir aumentos de lluvias ácidas en la región y conducir a liberación del flúor.
Estudios previos demostraron disminución en la germinación de semillas por agregado de fluoruro al agua [1]. Estos estudios fueron llevados a cabo con concentraciones de flúor 20 veces mayores que lo que se estima en nuestra provincia.
El flúor puede ser adicionado a tierras y por ende a aguas, como parte de productos agroquímicos [2]. Además, existen controversias sobre el contenido de flúor elevado de ciertos productos secundarios de la fabricación de fertilizantes [3,4].
Se demostró que los vegetales enriquecen su contenido en flúor en función del contenido de este elemento en el suelo en que crecen [5], existiendo escasa información sobre el efecto del contenido vegetal de flúor sobre el crecimiento de los cultivos. Existen algunos trabajos en los que se evaluaron efectos del fluoruro sobre actividades enzimáticas en plantas, pero las concentraciones utilizadas fueron 20 veces mayores que las halladas en agua [6]. Además es poco conocida la cantidad de flúor que se podría ingerir a través de vegetales que incorporan este elemento y su relación con la salud humana.
Se ha descripto  disminución de la preñez [7,8] y de la lactancia [9,10] en ganado. Se ha detectado también anormalidades fetales y abortos en mujeres residentes de zonas de fluorosis [11]. En años recientes este grupo de investigación detectó en zonas de Chubut fuentes de agua con contenido de flúor elevado, asociándose con una disminución en la preñez en bovinos y ovinos [12]. No hay estudios que permitan evaluar la ingesta de flúor por animales de pastoreo en función del contenido de flúor en vegetales.
Por todo lo mencionado anteriormente es que se han planteado los objetivos específicos de este proyecto, para determinar cómo y en qué medida podría el flúor estar afectando a la germinación, crecimiento y producción de las plantas de cultivo en nuestra provincia.

Objetivo específico 1: Obtener un mapa de la distribución de flúor en tierras de la provincia.
Se recolectarán muestras de tierra de diferentes sitios de la provincia. Como en el proyecto anterior, se contará con la colaboración de estudiantes de diferentes facultades oriundos de localidades de la provincia. Los mismos realizarán la recolección de muestras siguiendo instrucciones escritas. Un 10% de las localidades  serán muestreadas nuevamente por miembros del equipo de investigación de este proyecto para verificar su correcta recolección. Se determinará flúor en diferentes formas químicas: fluoruro, flúor ácido lábil y flúor en compuestos resistentes a la liberación por ácidos. El encargado de la medición desconocerá el origen de la muestra. Utilizando  los valores medidos y las coordenadas geográficas del lugar se confeccionará el gráfico correspondiente.

Objetivo específico 2: Determinar la fracción de flúor soluble e insoluble en tierras de la provincia.
Objetivo específico 3: Identificar las diferentes formas químicas en las que se encuentra el flúor.
Al realizar la determinación de flúor para cumplir con el plan del objetivo 1, se determinarán diferentes formas químicas bajo las cuales puede encontrarse el flúor: fluoruro, flúor ácido lábil y flúor ligado por enlaces resistentes a los ácidos. La proporción de fluoruro en la muestra indicará el contenido de flúor disponible que puede pasar al agua.

Objetivo específico 4: Evaluar factores físico-químicos que pueden aumentar la fracción biodisponible de flúor.
Los principales factores que pueden cambiar el tipo de compuestos bajo los que se encuentra el flúor en las tierras es el cambio de acidez del suelo (pH). Se evaluará el efecto de diferentes pH sobre el cambio de la proporción entre fluoruro, flúor ácido lábil y flúor ligado por enlaces resistentes a los ácidos.
Se evaluará este cambio en tierras, debido al tratamiento con soluciones ácidas y por los cambios generados en el suelo por el propio crecimiento de plantas. Se tomarán alícuotas de tierra de un cultivo de laboratorio, de la zona de la raíz y se monitorearán los cambios en las diferentes fracciones de flúor (ver metodología)

Objetivo específico 5: Determinar el contenido de flúor en vegetales y su relación con el contenido de flúor en agua y tierras. Evaluar su relación con la ingesta diaria de flúor recomendada en humanos.
Se medirá el contenido de flúor en vegetales de diferentes zonas y se analizará la relación que existe con el contenido de flúor en agua y tierras de la misma zona. En el momento de recolección de muestras de tierra se recolectarán vegetales de la misma zona.

Objetivo específico 6: Estudiar la capacidad germinativa, el crecimiento y metabolismo de las plantas de cultivo de la provincia en presencia de distintas concentraciones de flúor halladas en los suelos de regiones específicas.
Se realizarán en laboratorio cultivos experimentales de soja, trigo y maíz en los que se evaluará el poder germinativo, envejecimiento acelerado, crecimiento (medida hipocótilo y estudio microscópico), medidas de actividad fotosintética y de estrés (flavonoides). Estas mediciones se realizarán en cultivos con concentraciones de flúor en tierras utilizando en un primer lugar los valores extremos del rango de contenidos obtenidos al ejecutar el objetivo 1. Se compararán las variables mencionadas entre ambos grupos utilizando pruebas estadísticas adecuadas.

Objetivo específico 7: Determinar el contenido de flúor en productos agroquímicos.
Se realizará un muestreo de los principales compuestos agroquímicos (fertilizantes, herbicidas, inoculantes) utilizados en la provincia. Se determinará el contenido de flúor en los mismos y se calculará en función de su modo de empleo el agregado de flúor a la tierra.

Objetivo específico 8: Evaluar la relación entre contenido de flúor soluble e insoluble en tierras con el promedio anual de lluvias.
La lluvia podría ser una causa de cambio en el contenido de flúor en la tierra, especialmente de aquellas especies químicas que son solubles. Para evaluar esta relación se obtendrá el promedio anual de lluvias en diferentes sitios de la provincia y se correlacionará el mismo con el contenido de los diferentes tipos de compuestos con flúor en la tierra.

Objetivo específico 9: Relacionar el contenido de flúor en tierra con la producción agrícola del lugar.
Se correlacionará el contenido de las diferentes formas químicas de flúor en tierras  con la producción agrícola de cada región obtenida a partir de información de base de datos del IPEC: http://www.santafe.gov.ar/archivos/estadisticas

Objetivo específico 10: Evaluar el posible enriquecimiento en flúor de la tierra por la aplicación de riego artificial con aguas de napa.
Se realizarán experiencias en laboratorio, produciendo riego de cultivos, utilizando aguas con contenidos de fluoruro coincidentes con los valores de menor, medio y alto  contenido de flúor hallado en la provincia en la ejecución del objetivo 1. Se evaluará luego de un ciclo de crecimiento de las plantas, el contenido de flúor bajo sus diferentes especies, tanto en la tierra como en los vegetales que se estudien. En este caso el experimento se realizará en pequeños sectores utilizando verduras (lechuga o acelga), dado que el sector que recurre a riego es fundamentalmente el hortícola.

Metodología

Medida de la concentración de fluoruro: Se realizará por potenciometría directa con un electrodo de ión específico Orion 94-09, procesando simultáneamene estándares de fluoruro de sodio.
Medida de la concentración de flúor ácido lábil: Se realizará por potenciometría directa luego de destilación isotérmica  con ácido fosfórico concentrado a 60 °C.
Determinación de Poder Germinativo (PG): Este procedimiento se usa para determinar el porcentaje de semillas de un lote que serán capaces de producir una plántula normal bajo condiciones de germinación óptimas. Una determinada cantidad de semillas se siembran sobre una cama (de arena o tierra) cubriéndolas totalmente y se llevan a una cámara a 25°C con alternancia de 8hs luz y 16hs oscuridad. Luego de 5 días, se realiza la primer lectura, donde se cuentan las plántulas que emergen sobre el nivel del sustrato sin extraerlas, dato que será considerado como el de Energía Germinativa (EG). Las bandejas se colocan nuevamente en la cámara de 25ºC hasta el día de la lectura final, cuando se extraerán las plántulas y se observaran todas sus estructuras. Se clasifican en: plántulas normales, plántulas anormales, semillas muertas, semillas duras, semillas frescas no germinadas y semillas vanas. Los criterios de clasificación son los establecidos por ISTA y descritos en el Manual de Evaluación de plántulas (3ra Edición). Se considera PG a la cantidad de plántulas normales expresado como % del total de semillas sembradas.
Test de envejecimiento acelerado: El método más aconsejado para conocer el vigor de la soja es el test de envejecimiento acelerado, que consiste en someter las semillas a un estrés de temperatura a 41°C y humedad relativa del 100% durante 72 hs, con posterior determinación del poder germinativo.
Medida del hipocótilo en oscuridad: Se siembra una determinada cantidad de semillas en placa y se dejan 3 días en oscuridad. Al tercer día, se sacan una hora a la luz y se dejan en oscuridad por 6 días más. Finalmente, se extraen de la placa y se mide la longitud del hipocótilo.
Estudio microscópico: A distintas edades se efectúan cortes transversales y longitudinales de zonas marcadas en el hipocótilo apenas comienza a germinar. Se determinan parámetros celulares: espesor de tejidos y dimensiones celulares de los distintos tejidos  Simultáneamente, en la preparación se observa la existencia de material lignificado.
Medida de VO2: Se mide la velocidad de fotosíntesis a través de la velocidad de producción de oxígeno con un electrodo de Clark por parte de una hoja a la cual se le suministra luz y CO2  en una cámara herméticamente cerrada.
Determinación de flavonoides: Los flavonoides aumentan cuando a la planta se la somete a situaciones de estrés como puede ser la falta de agua, infecciones fúngicas o bacterianas, radiaciones UV y frío. La técnica consiste en la extracción de los flavonoides de la planta y su medida espectrofotométricamente.
Datos de bases de datos: Se utilizarán bases de datos de la provincia de Santa Fe disponible en la web (http://www.santafe.gov.ar/archivos/estadisticas).
Herramientas matemáticas e informática: Las correlaciones y análisis de datos se realizarán con los softwares: Graph Pad 2.0, MatLab 7.0, Origin 3.0 y R 2.9.2.

1. Sudhakar Pant,a Prabhakar Pant,b PV Bhiravamurthyc. Effects of fluoride on early root and shoot growth of        typical crop plants of india  Fluoride 4:57–60.2008.
2. Pang X, Li D, Peng A. Environ Sci Pollut Res Int. 2002;9(2):143-8.Application of rare-earth elements in the agriculture of China and its environmental behavior in soil.
3. Hallin IL, Naeth MA, Chanasyk DS, Nichol CK.J Assessment of a reclamation cover system for phosphogypsum stacks in Central Alberta, Canada.   Environ Qual. 39:2160-9. 2010
4.Gouider M, Feki M, Sayadi S. Bioassay and use in irrigation of untreated and treated wastewaters from phosphate fertilizer industry. Ecotoxicol Environ Saf. 73:932-8. 2010    
5. Stanley VA, Shaleesha A, Murthy PB, Pillai KS. Retarding fluoride accumulation in Amaranthes viridis through liming and implications of phosphorous treatment. J Environ Biol. 23:265-9. 2002
6. Ross CW, Wiebe HH, Miller GW. Effect of fluoride on glucose catabolism in plant leaves. Plant Physiol:305-309. 1961
7. McClure TJ. A review of developments in nutrition as it is related to fertility in cattle. N Z Vet J. 18:61-8. 1970. 
8. Suttie JW, Carlson JR, Faltin EC. Effects of alternating periods of high and low Fluoride ingestion on Diary Cattle. Journal of Diary Science. 55:6.1971
9. Yuan SD, Song KQ, Xie QW, Lu FY.An experimental study of inhibition on lactation in fluorosis rats. Sheng Li Xue Bao. 43(5):512-7. 1991         
10. Eckerlin RH, Maylin GA, Krook L. Milk production of cows fed fluoride contaminated commercial feed.Cornell Vet.76:403-14. 1986
11. Shi J, Dai G, Zhang Z. Relationship between bone fluoride content, pathological change in bone of aborted fetuses and maternal fluoride level. Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. Mar;29(2):103-5. 1995
12. Informe técnico producido a pedido de Cominagro SA. Trelew. Chubut. Argentina.

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4. Medida de la remodelación ósea utilizando fluoruro como trazador del proceso. Desarrollo de una técnica miniinvasiva para medida de la remodelación en ratas.

Integrantes: Lic. Maela Lupo, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto subsidiado por CONICET (PIP 2009-2011)

Antecedentes

Generalidades

El tejido óseo se origina por dos mecanismos: osificación intramembranosa y osificación endocondral. Ambos procesos conducen a la formación de un mismo tipo de hueso, que luego se mantiene por el proceso de remodelación ósea, por el cual el tejido óseo se renueva. La remodelación ósea consta de dos procesos básicos que son: la resorción o remoción de tejido óseo y la formación de nuevo tejido en su lugar (siempre la resorción precede a la formación).La secuencia de remodelación es: activación, resorción y formación (secuencia ARF). La resorción ósea es el proceso por el cual se destruye el hueso. Los osteoclastos son las principales células encargadas de la resorción, también pueden producir resorción los osteocitos. Los monocitos y macrófagos participan en la resorción pero su rol es poco importante. Entre la etapa de resorción y la de formación, se da un proceso conocido como fase de reversión, en el cual las células mononucleares, como macrófagos, forman una capa de cemento que une el hueso neoformado con el tejido óseo existente.
Una vez formada la matriz ósea, el hueso se calcifica, proceso que se inicia por vesículas de matriz exocitada por osteoblastos, los cuales actúan como núcleos. La velocidad de mineralización depende de la presencia de pirofosfato, proteínas no colágenas acídicas de la matriz ósea y de la expresión de fosfatasa alcalina en la membrana del osteoblasto.
Normalmente los procesos de resorción y formación ósea están acoplados, es decir la resorción y formación proceden en igual magnitud. Estos procesos mantienen la estructura del hueso, removiendo hueso antiguo, con defectos o con microfracturas y rellenando con tejido óseo nuevo [1]. En algunas patologías el proceso de remodelación (resorción-formación) puede estar aumentado o disminuido respecto del valor normal, no siendo ninguna de las dos situaciones deseables.
La medición de la remodelación ósea es un proceso que ha sido encarado de maneras diferentes, dependiendo si se trata de necesidades clínicas o de investigación básica.

Diferentes formas de medición de la remodelación ósea
Una técnica utilizada para la determinación de la remodelación ósea es la histomorfometría ósea [2]. Requiere la toma de biopsias ósea y el procesamiento histológico del material. Se realiza sobre cortes histológicos de hueso sin desmineralizar, incluido en metilmetacrilato, teñidos con azul de toluidina o bien sobre cortes de tejidos en parafina con tinción con hematoxilina eosina. El análisis de los resultados puede dar medidas de la remodelación ósea, pero la dificultad es que informará respecto de la zona donde se obtuvo la biopsia. Existen diferentes tipos de índices: estáticos y dinámicos. Los parámetros que se pueden medir son numerosos y la aparición de software de análisis de imágenes ha contribuido a hacer estas mediciones de manera cuantitativa.
Otra técnica es por medio de la utilización de marcadores óseos, que son moléculas cuya concentración se puede medir en plasma y orina, e indican el estado metabólico del tejido óseo [3,4,5]. Sus concentraciones se detectan habitualmente por ELISA, IRMA o RIA. Existen diversas marcas comerciales y tipos de ensayos para cada uno. Los valores de referencia dependen de las marcas comerciales y la metodología utilizada. Los marcadores bioquímicos óseos son de amplia aplicación en la clínica, dan una medida global del esqueleto, pero sus datos no siempre se correlacionan con la clínica o la realidad dentro del tejido óseo. Además son costosos y en algunos casos no solo representan el estado de la remodelación ósea. Existen marcadores de resorción y formación ósea. Los marcadores de formación más utilizados son: fosfatasa alcalina total, fosfatasa alcalina ósea, osteocalcina (BGP). Entre los marcadores de resorción en la actualidad se dispone de hidroxiprolina, piridinolina (Pyr), deoxipiridinolina (D-Pyr), telopéptidos: NTX (amino terminal) y cross laps, catepsina K, sRANKL, péptido helicoidal.
Por último, se puede tener en cuenta, que el calcio y el fosfato son dos iones utilizados en la formación del cristal de hidroxiapatita, responsable de la calcificación del hueso. Existen iones que tienen afinidad específica por el tejido óseo y pueden ser utilizados como trazadores de dicho tejido. La captación de calcio radiactivo por el hueso [6] como la de algunos bisfosfonatos con trazadores radiactivos que reemplazan al fosfato en el cristal han sido utilizados como medida de la resorción ósea [7,8].
Existen otros iones que pueden ser intercambiados por otras partes del cristal, tal es el caso del estroncio y del fluoruro.
La medición de la remodelación ósea y los resultados obtenidos sigue siendo un problema en la clínica y en la investigación básica especialmente con animales, donde los marcadores bioquímicos óseos no están tan desarrollados

Estudios preliminares
En el laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario el fluoruro ha sido utilizado como trazador del tejido óseo [9]. En el trabajo citado se comparó la captación de fluoruro con la captación de metilbisfosfonato marcado con 99mTc. Se halló que en pacientes en los cuales se ve aumentado el proceso de remodelación ósea, como ocurre durante las bajas ingestas de calcio, la retención corporal de fluoruro se hallaba aumentada y esto, correlaciona adecuadamente con otros parámetros de la remodelación ósea como son la excreción urinaria de hidroxiprolina y de la fosfatasa alcalina ósea. Sin embargo la técnica carece de adecuada sensibilidad para detectar pequeños cambios, y como se determina por la excreción urinaria de fluoruro, el resultado puede ser erróneo si la persona esta consumiendo flúor de alguna fuente (agua fluorada). Esta técnica fue utilizada en seres humanos pero no se adecuó al uso en animales de experimentación.
La medición de la remodelación ósea en animales de experimentación es necesaria para evaluar el progreso del tratamiento con drogas que tienen efecto sobre el tejido óseo, cuando estas sustancias se encuentran en fase de desarrollo.
En el laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario se ha avanzado en la obtención de un modelo farmacocinético para el fluoruro de sodio y el monofluorofosfato de sodio [10,11,12]. Estos modelos vislumbran que a través de modificaciones en los mismos y la combinación con procedimientos quirúrgicos sencillos, podrían aportar una medida de la remodelación ósea en la rata, utilizando el fluoruro de sodio como trazador.

Objetivo general
Desarrollar un método de medición de la remodelación ósea en la rata utilizando fluoruro (F) como trazador del tejido óseo.

Objetivos específicos
• Desarrollar un modelo matemático para la medición de constantes farmacocinéticas del fluoruro de sodio en la rata, que permitan estimar la remodelación ósea.
• Desarrollar un método de cálculo para la obtención de los valores de dichas constantes.
• Desarrollar un método mini-invasivo de obtención de muestras biológicas para la determinación de las variables involucradas en el cálculo de las constantes farmacocinéticas.
• Obtener los valores de las constantes farmacocinéticas en ratas normales.
• Obtener los valores de las constantes farmacocinéticas en situaciones donde la remodelación ósea se encuentre modificada
• Desarrollar un software para la determinación de las constantes farmacocinéticas

Metodología

Plan para dosis intravenosa (i.v.)

Se desarrollará un modelo matemático que permita medir la velocidad de captación de fluoruro por el hueso luego de una dosis intravenosa de fluoruro de sodio. La ventaja de este método radicaría en que se eliminarían los procesos gastrointestinales de absorción, de difícil cuantificación, y permitiría un mejor control de la dosis a administrar.

Requisitos:
• Este método se llevara a cabo por medio de una dosis intravenosa de solución de fluoruro de sodio de concentración adecuada a la línea y peso del animal.
• Es necesaria la utilización de anestesia para poder realizar la inyección intravenosa.
• Se obtendrán muestras de sangre con anticoagulante.

Cálculo teórico de dosis de NaF i.v.:
La cantidad de fluoruro a inyectar se calculará en función del peso del animal, la volemia, y la concentración de fluoruro plasmático máximo tolerado sin cambios apreciables en la salud del animal.

Materiales y Métodos

• Herramientas matemáticas de análisis:

1. Planteo de ecuaciones diferenciales [13-16]
2. Resolución de ecuaciones diferenciales por transformadas de Laplace [17]

• Planteo de modelos biológicos:

Se utilizarán ratas normales, hembras, de 7 semanas de vida (adultas). Se trabajará con ratas hembras dado que la pérdida de tejido óseo asociado a la disminución de la función ovárica es un tema de interés en la salud humana, por la incidencia de osteoporosis en mujeres postmenopáusicas. El trabajo con ratas hembras permitirá analizar la remodelación ósea en modelos que reproducen esta situación.
También se utilizarán ratas normales hembras o machos, a las cuales se les realizará cirugías como paratiroidectomía, etc., para validar el modelo en ratas en las que la remodelación ósea se vea modificada.

• Trabajos con ratas [18]

1. inyección intravenosa a través de la vena de la cola.
2. Administración de sustancias por sonda gástrica.
3. Recolección de orina en jaulas metabólicas.
4. Obtención de sangre de la punta de la cola y de vena de la cola
5. Cirugías para la producción de animales con remodelación ósea modificada (por ejemplo ovariectomía y paratiroidectomía)

• Eutanasia de los animales:
Cuando se lo requiera los animales serán sacrificados por una inyección intracardíaca de 0.5 ml de KCl saturado, con el animal en profundo estado de analgesia y anestesia (inhalatoria con éter sulfúrico o inyectable con ketamina y xilazina)[19].

• Anestesia:
En función del avance en la metodología se optará por anestesia inhalatoria con éter sulfúrico o por vía intramuscular con xilazina y ketamina [18]. De ser necesario se utilizará anestesia local con Clorhidrato de lidocaína y analgésicos.

• Cuidados del criadero
Cuando se mantengan animales en criadero, se utilizará un ambiente climatizado (24-27 °C), con ciclo luz-oscuridad (12 hs - 12 hs). Los animales recibirán alimento balanceado para roedores y agua ad-libitum.

• Determinaciones de la concentración de flúor [20]:

1. En plasma: se utilizará potenciometria post-destilación isotérmica. La técnica utiliza (50-100) μl plasma [21].

2. En orina: se utilizará potenciometria directa (100 μl orina). La orina es un fluido donde por lo general no existen concentraciones importantes de metales trivalentes que complejan el fluoruro. Por lo tanto, la medición potenciométrica de fluoruro puede llevarse a cabo ajustando el pH de la muestra y la fuerza iónica.

La determinación se realiza con un electrodo de ión específico Orion 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl. El voltaje desarrollado es directamente proporcional al logaritmo de la concentración de fluoruro en la muestra. Se procesan simultáneamente patrones acuosos de NaF de concentraciones adecuadas a las muestras. El ajuste de curvas de calibración se realizará utilizando softwares adecuados (Prism.Graph Pad 2.0, Origin 3.0) con el método de los mínimos cuadrados.


Referencias
1. Olsen BR, Reginato AM, Wang W. Bone development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000, 16:191-220.
2. Parfitt AM..Bone histomorphometry: proposed system for standardization of nomenclature, symbols, and units. Calcif. Tissue Int. 1988, 42:284-286
3. Delmas PD, Wahner HW, Mann KG, Riggs BL. Assessment of bone turnover in postmenopausal osteoporosis by measurement of serum bone Gla-protein. J. Lab. Clin. Med. 1983, 102:470-475.
4. Nobbs BT, Walker AW, Davies TJ. A simplified method for the estimation of urinary total hydroxyproline. Clin. Chim. Acta 1975, 64:219-225.
5. Puche RC, Caferra DA, Rosillo I. Bone isoenzyme of serum alkaline phosphatase measured with wheat germ agglutinin. Clin. Chem. 1988, 34:219-225.
6. Reeve J. Radiotracer methods for studying bone formation and its disorders. In. Christiansen C, Arnaud CD, Nordin BEC, Parfit AM, Peck WA, Riggs BL, Eds. Osteoporosis. Copenhagen, Dept of Clinical Chemistry, Glostrup Hospital. 1984, 133-138.
7. Hyldstrup L, Mogesen N, Jensen GF, Transbolt I. Urinay 99m-Tc diphosphonate excretion as a simple method to quantify bone metabolism. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1984, 44:105-109.
8. Thomsen K; Rodbro P, Christiansen C. Bone turnover determined by urinary excretion of 99m-Tc diphosphonate in the prediction of postmenopausal bone loss. Bone Miner. 1987, 2:125-132..
9. Puche RC, Rigalli A, Trumper L, Dip O, Pereyra JL, Poudes G, Roberti A, Bocanera R, Tozzini R. Estimation of bone turnover in climateric women by the whole body retention of fluoride. Maturitas 1991, 14:57 64.
10. Rigalli A, Ballina JC, Beinlich A, Alloatti R, Puche RC. Pharmacokinetics differences between sodium fluoride and sodium monofluorphosphate and comparative bone mass increasing activity of both compounds, in the rat. Arzneimittelforschung 1994, 44:762 766.
11. Rigalli A, Cabrerizo M, Beinlich A, Puche RC. Gastric and intestinal absorption of monofluorphosphate and fluoride in the rat. Arzneimittelforschung 1994, 44:651 655.
12. Rigalli A, Morosano M, Puche RC. Bioavailability of fluoride administered as sodium fluoride or sodium monofluorophosphate to human volunteers. Arzneimittelforschung 1996, 46:531-533.
13. Stewart J. Conceptos y contextos. International Thomson Editores. México. 1999.
14. Edwards CH, Penney DE. Ecuaciones diferenciales elementales. Prentice- Hall Hispanoamérica. SA. México. 3ra Edición. 1993.
15. Cruichshank S. Mathematics and statistics in anaesthesia. Oxford Medical Press. New York. 1998.
16. Thomas JR, George B. Calculo. Una Variable. Undécima edición. Person Educación. México. 2006
17. Rigalli A, Aguirre C, Armendáriz M, Cassiraga G. Formulación de Modelos Matemáticos de Fenómenos Biológicos. ISBN 950-673-371-6 . Ed de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2003.
18. Rigalli A, Di Loreto V. Manual de Cirugía en la Rata y otras técnicas en medicina experimental. ISBN 950-673-464-X. Ed. de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2005.
19. Canadian Council on animal care Guidelines. Guide to the care and use of experimental animal. Vol 1. Chapter 12. Euthanasia. www.ccac.ca
20. Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LRM. Determinación de la concentración de flúor en muestras biológicas. Ed. de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. ISBN 978-950-673-616-3. 2007
21. Rigalli A, Alloatti R, Puche RC. Measurement of Total and Diffusible Serum Fluoride. J Clin Lab Anal. 1999, 13:151-157.

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5. Cooperación Internacional - Proyecto conjunto: Evaluation of insulin signal in muscle and liver in diabetic or not rats after chronic exposure to fluoride.

Integrantes: Lic. Mercedes Lombarte, Lic. Brenda L Fina, Dra. Maela Lupo,
Dr. Alfredo Rigalli.

CONICET
Laboratorio de Biología Ósea.
Facultad de Ciencias Médicas. UNRosario. Santa Fe 3100. Rosario.
Titular del Proyecto parte Argentina: Dr. Alfredo Rigalli.

FAPESP
University of São Paulo - Bauru Dental School.
Street: Al. Dr. Octavio Pinheiro Brisolla, 9-75. Bauru.  Brazil
Titular del proyecto contraparte Brasil: Marília Afonso Rabelo Buzalaf.

Antecedentes
El fluoruro es utilizado con fines terapéuticos en el tratamiento de la osteoporosis [1] y la prevención de caries dentales [2]. Por otra parte la ingesta espontánea de fluoruro en el agua de bebida es la principal vía de ingreso de flúor al organismo. Cuando la concentración de flúor en agua no supera 1,5 mg/l, no se describen efectos adversos, sin embargo por encima de estos valores se presentan diversas alteraciones metabólicas que configuran diferentes cuadros de un estado conocido como fluorosis,que afecta a millones de personas en el mundo. La fluorosis es una complicación que se presenta cuando la ingesta de flúor supera 2 mg/día, alcanzando diversos grados de gravedad, de acuerdo a la dosis diaria. La alteración de la secreción y de la respuesta insulínica ha sido descripta por primera vez y ampliamente estudiada en nuestro laboratorio [3,4,5,6,7,8,9]. La inhibición de la secreción de insulina luego de una dosis terapéutica y la resistencia a la insulina en exposiciones crónicas son los rasgos principales. La exposición crónica al flúor es común en poblaciones que ingieren aguas con contenidos de flúor elevado, como existe en varias regiones de nuestro país [6] y en otros países como la india [10]. Se ha demostrado que la resistencia a la insulina es en parte por la presencia de precursores de insulina con menor efecto a nivel de los tejidos blancos [8] y por otra parte por alteración de la transducción de señales corriente abajo del receptor de insulina [11]. Resultado a nivel proteómio indican alteración de enzimas relacionadas al metabolismo energético a nivel renal [12]. Estudios recientes de nuestro laboratorio indica que la resistencia a la insulina disminuye por la actividad física en ratas con un plan de entrenamiento en cinta ergométrica (datos no publicados).
La interrelación entre el efecto del fluoruro sobre la respuesta insulínica y el metabolismo óseo está muy bien demostrado [4]. En ratas en crecimiento la captación de fluoruro ósea debido al alto recambio óseo asociado al crecimiento permite la normalización del metabolismo glucídico. Sin embargo este fenómeno no ocurre con ratas adultas o con insuficiencia renal, en las que la acumulación de fluoruro en plasma es más importante [9]. Al presente se ha obtenido evidencia que el fluoruro simultáneamente con los efectos mencionados modifica el funcionamiento de la cadena respiratorio y el estrés oxidativo, pudiendo atribuirse en parte a estas modificaciones, las alteraciones óseas observadas en ratas tratadas con fluoruro de sodio [13].
El monofluorofosfato de sodio (MFP) es una droga que genera fluoruro por su metabolización y no presenta los efectos observado en tratamientos crónicos con fluoruro [5,14]. El PIP 2009-2011 adjudicado por CONICET tiene como objetivos profundizar en los efectos óseos y no óseos del MFP.
El trabajo en colaborativo con el laboratorio dirigido por la Dra Buzalaf permitirá complementar los estudios en el área de proteómica, respuesta insulínica, ejercicio físico y consumo de oxígeno en ratas con exposición crónica al fluoruro.

Referencias
1- Riggs BL, et al. J. Bone Miner. Res. 9:265-275.1994.
2- Stephen  KW. Adv Dent Res 8:185-9.1994.
3- Rigalli A, et al. Calcif Tissue Int. 46:433-438. 1990
4- Rigalli A, et al. Bone and Min. 16:101‑108. 1992
5- Rigalli A, et al. Arzneimittelforschung. 45:289‑292. 1995
6- de la Sota M, Rigalli A, et al. Medicina (B Aires). 57:417-420.1997
7- Menoyo I, Rigalli A, et al. Arzneimittelforschung 55: 455-460.2005
8- Menoyo I, Rigalli A, et al. Fluoride. 41:260-269.2008.
9- Lupo M, Buzalaf M, Rigalli A. Biol Trace Elem Res. in press
10- Trivedi N et al Diabetologia 36:826-828.1993.
11- Yamamoto F, et al. Fluoride 43:25-30
12 Kobayashi C, Buzalaf M, et al. Chem Biol Interact. 2009 Jul 15;180(2):305-11.
13- Brun L, Rigalli A. Biomed Pharmacother. 64:1-6.2010
14- Rigalli A, et al. Arzneimittelforschung. 44(I), 762‑766.1994.

Objetivos a concretar en el laboratorio Argentino:
1- Evaluar la respuesta insulínica en ratas normales y diabéticas con exposición crónica al fluoruro.
2- Evaluar el efecto del ejercicio físico sobre la resistencia a la insulina en ratas tratadas crónicamente con fluoruro.
3- Evaluar las modificaciones del consumo de oxígeno por tejidos de ratas expuestos a tratamiento crónico con fluoruro.

Tareas a realizar:
Análisis proteómico a nivel de musculatura estriada en ratas tratadas con fluoruro (Brasil).
Estudio del estado de fosforilación de IRS en la cascada de señalización de insulina en tejidos blancos (Brasil).
Medida de consumo de oxígeno in vivo e in vitro (Argentina).
Medida de la eficiencia de conversión de alimentos (Argentina).
Medidas de resistencia a la insulina a través de pruebas funcionales: clamp euglicémico hipeinsulínemico, pruebas intravenosa de tolerancia a la insulina y HOMA-IR (Argentina).
Efecto del ejercicio físico controlado en ratas normales y diabéticas con y sin tratamiento con fluoruro enel agua de bebida (Argentina).

Resultados previstos
Las actividades a desarrollar previstas en este proyecto de cooperación arrojarán resultados que permitirán comprender el mecanismo de acción del fluoruro a nivel tisular y contribuirán a prevenir o tratar efectos adversos originados por la fluorosis.

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6. Desarrollo de un páncreas artificial en ratas: Integración de herramientas computacionales y matemáticas para el control de la glucemia en ratas con diabetes mellitus tipo I

Integrantes: Lic. Mercedes Lombarte, Dr. Germán Campetelli, Dra. Marta Basualdo, Dr. Alfredo Rigalli

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers.

Introducción
La diabetes mellitus tipo I es una patología que afecta a millones de personas en el mundo. Actualmente se controla a través de inyecciones de insulina por vía subcutánea y con controles periódicos de los niveles de glucosa plasmática. El acompañamiento de esta terapéutica con un adecuado estilo de vida aproxima a los pacientes a una muy buena calidad de vida. Sin embargo la necesidad de utilizar técnicas invasivas para la medición de glucosa y la administración de insulina, y el riesgo de padecer hipoglucemia es un problema latente en esta terapia. Si bien las complicaciones a largo plazo se reducen con un buen tratamiento, la desaparición de las mismas es imposible debido a que los valores de glucemia están parte del tiempo por encima de los valores normales, conduciendo a glicosilación de proteínas afectando así funciones vitales para el organismo.
El desarrollo de técnicas mini-invasivas para la medida de glucosa y administración de insulina ha progresado enormemente y el desarrollo de nuevas tecnologías viene recibiendo gran inversión. Si bien las bombas de infusión de insulina han avanzado y se han tornado más populares, los sensores continuos subcutáneos no lo han hecho en forma paralela. El funcionamiento de ambos en forma simultánea y conjunta constituye un “pancreas artificial”. Éste consta de un “hardware” (bomba insulina + sensor de glucosa) y un “software” (modelo matemático + controlador). Si bien los avances alcanzados parecerían mostrar que no está lejos de lograse el “hardware” necesario, el progreso a nivel del “software” muestra que los modelos matemáticos subyacentes requieren perfeccionamiento.
Existen grupos de investigación a nivel mundial que trabajan en el mejoramiento de los sistemas de control, testeándolos con simuladores y en algunos casos en pacientes. La FDA ha aprobado un simulador del sistema glucosa insulina en humanos que permite evitar las investigaciones preclínicas en animales.
Este avance por otro lado ha producido un decrecimiento enorme de las investigaciones en animales con los fines de implementar un páncreas artificial.
En la Cátedra de Química Biológica de la Universidad Nacional de Rosario se está trabajando en el desarrollo de un modelo matemático del sistema glucosa-insulina en ratas y en el Centro Internacional Franco Argentino de Ciencias de la Información y de Sistemas se poseen las herramientas de control necesarias para utilizar el modelo matemático mencionado en la implementación de un páncreas artificial en ratas. Por otra parte el grupo de trabajo de este proyecto está trabajando en un modelo de escalado rata-humano que permitirá extrapolar los datos obtenidos en experimentación en ratas, a humanos.

Objetivos
1- Desarrollar un modelo matemático y un software que permita el control de la glucemia en ratas diabéticas.
2- Desarrollar una estrategia de laboratorio para implementar un páncreas artificial en ratas.
3- Aplicar las herramientas de control desarrolladas para controlar la glucemia utilizando un sistema a lazo cerrado (páncreas artificial) en ratas diabéticas.

Materiales y Métodos
El proyecto propuesto tiene 3 fases:
Fase 1- Desarrollo de un modelo matemático que describa la homeostasis de la glucosa en ratas diabéticas y de un software que controle la infusión continua de insulina en respuesta a los niveles plasmáticos de glucosa obtenidos en tiempo real. Esta etapa del proyecto utiliza únicamente herramientas del análisis matemático, informáticas y de simulación.
Fase 2- Desarrollo de un equipamiento para montar un páncreas artificial en ratas. Esta etapa requiere el desarrollo de la metodología que pueda ser aplicable a ratas diabéticas, estando estas sin efectos anestésicos o sedativos. Se dispone del sistema para infusión de insulina y del instrumental para obtener valores de glucosa plasmática a lo largo del tiempo. La dificultad que tiene que superar este equipo de investigación es lograr mantener la inyección continua de insulina con la rata despierta, llevando su vida normal. Se intenta desarrollar un modelo experimental que se aproxime en lo posible a un paciente diabético realizando sus actividades cotidianas.
Fase 3- Implementación de un páncreas artificial. Para realizar los experimentos se utilizarán ratas de la línea Sprague Dawley en las que se inducirá la diabetes por inyección intraperitoneal de estrepotozocina. Luego de comprobada la presencia de la enfermedad se realizarán los estudios para calcular la dosis de insulina subcutánea necesaria para normalizar la glucemia y se calcularan los parámetros del modelo matemático. A través de una mini dosis de insulina se perturbará el sistema glucosa-insulina, de manera de obtener una respuesta que permita ajustar el software que controlará la bomba de infusión de insulina con el sensor de glucosa.
Debido al costo de los sensores continuos de glucosa, en esta primer etapa se utilizarán mediciones de glucosa sanguínea por espectrofotometría.

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7. Efecto del fluoruro sobre parámetros relacionados con la resistencia a la insulina en líneas de ratas y ratones con diferente susceptibilidad genética a la fluorosis.

Integrantes: Lic. Mercedes Lombarte, Lic. Brenda L Fina, Hilda Moreno, Ornella Acciarri, Hernán Biset, Tomás Woelflin, Dr. Alfredo Rigalli

Introducción

El fluoruro es una sustancia de origen natural que se utiliza ampliamente en diversas industrias y a nivel de salud humana se lo utiliza en la prevención y tratamiento de la osteoporosis, estando actualmente en desuso y reemplazado por otras drogas con el mismo efecto terapéutico. Sin embargo, a nivel de la prevención de caries es muy utilizado en la odontología. La inclusión del fluoruro en pastas dentales, barnices y enjuagues bucales es una práctica frecuente. Otra forma muy utilizada es el agregado de fluoruro al agua de consumo en concentraciones que tengan efecto beneficioso sobre la dentadura.
A pesar de los efectos beneficiosos del fluoruro, está demostrado que la ingesta por encima de ciertos valores produce un cuadro conocido como fluorosis, que puede producir signos leves como puede ser el moteado de dientes, hasta problemas severos como alteración de la regulación hormonal e incapacitantes efectos a nivel óseo y de articulaciones. La principal vía de ingreso del fluoruro al organismo es con el agua de bebida, por esta razón se han establecido límites máximos de concentración. La Organización Mundial de la Salud ha establecido como límite máximo 1.5 ppm. Son numerosos los trabajos que documentan la relación entre la concentración de fluoruro y la fluorosis, siendo un tema controversial. Un trabajo reciente llevado a cabo con 80000 niños en China demuestra que los signos de fluorosis dental y ósea aparecen aun con concentraciones inferiores a los valores límites establecidos por la OMS. Lo notable de todos los trabajos es que aun en poblaciones muy homogéneas la presentación de la fluorosis no es en un 100% de los individuos, existiendo algunos que por razones desconocidas presentan resistencia.
El efecto de la ingesta de fluoruro sobre la secreción y respuesta a la insulina es una de las complicaciones de la ingesta crónica de fluoruro que está siendo considerada con mucha atención. Este efecto deletéreo de la ingesta de fluoruro ha sido descriptos hace 20 años y desde entonces se han reportado gran cantidad de trabajos que demuestran el efecto en seres humanos en nuestro país como en el extranjero.
Ha sido demostrado que ratas de la línea Sprague-Dawley desarrollan resistencia a la insulina luego del tratamiento con fluoruro de sodio (NaF). Experimentos similares realizados con ratas de la línea Wistar no desarrollan resistencia a la insulina [resultados de los grupos de este proyecto aun no publicados]. En los trabajos mencionados se ha demostrado que luego de la ingestión de agua con 15 ppm de fluoruro, las ratas presentan mayores niveles de insulina que los controles sin cambios en la glucemia. Como consecuencia se observa un incremento significativo en el índice de resistencia a la insulina conocido como HOMA-IR.
La diferencia de comportamiento de ambas líneas de ratas no puede ser atribuida a dosis, sexo, tiempo de tratamiento, edad o alimentación. La diferencia de respuesta podría deberse a diferencias genéticas no investigadas en lo que respecta a la respuesta de ambas líneas ante la ingesta crónica de fluoruro.
Es conocido que los efectos del fluoruro son dependientes de la concentración en plasma, variable que depende de la dosis utilizada y de la forma de administración (única dosis diaria o administración continua en el agua de bebida). También son factores determinantes de la acción del fluoruro, la tasa de remodelado óseo, la etapa de crecimiento en que se encuentran los animales, la función renal y la función gastrointestinal. Es predictible que algunos de estos factores sean diferentes entre las líneas de ratas mencionadas. Las diferencias en alguna de las funciones mencionas se deberían a diferente expresión de proteínas. La identificación de estas proteínas podría explicar la diferencia entre ambas líneas de ratas.
Estudios preliminares han demostrado que en diversas líneas de ratones, la fluorosis se presenta con diferentes grados aun con dosis equivalentes. Ratones de la línea A/J (línea susceptible a la fluorosis dental) desarrollaron un cuadro de fluorosis al consumir agua con 25 ppm de fluoruro. Mientras que ratones de la línea 129P3/J (línea resistente al desarrollo de fluorosis) no desarrollaron signos de fluorosis con la misma concentración de fluoruro en agua. Ambas líneas incorporaron cantidades similares de fluoruro en hueso e incisivos. El metabolismo glucídico no fue estudiado en estos animales.
El fluoruro que ingresa por vía oral se distribuye en plasma y tejidos blandos siendo luego depurado por hueso y riñón. Los efectos del fluoruro son dependientes en su mayoría de la concentración que el anión alcanza en los fluidos del organismo. La función intestinal, renal y ósea son las determinantes de la concentración plasmática de fluoruro. Se estima que la susceptibilidad al fluoruro dependerá de estas vías de depuración y la expresión diferencial de ciertas proteínas.
Las diferentes respuestas halladas entre las líneas de animales confrontan con la posibilidad de que sean sus diferencias genéticas las que determinen la resistencia a la producción de efectos adversos del fluoruro.

La identificación de las características fenotípicas de cada línea de ratas y ratones podría ser de gran valor para comprender los factores determinantes de los efectos adversos y benéficos del fluoruro, permitiendo anticiparse en la identificación de sujetos sensibles o resistentes a la fluorosis. Este conocimiento será de valor tanto para evitar la presentación de efectos adversos como para encarar terapéuticas que utilicen fluoruro.

Objetivos

Objetivo General
El objetivo general de este proyecto es determinar los factores fisiológicos y las proteínas involucradas que pudieran explicar las diferencias en el metabolismo glucídico entre líneas de ratas y de ratones

Objetivo específicos
1- Evaluar la función renal en ambas líneas de ratas, la excreción urinaria de fluoruro y su relación con la resistencia a la insulina.
2- Evaluar el metabolismo óseo en ambas líneas
3- Evaluar los parámetros del metabolismo glucídico en ambas líneas de ratas con y sin la administración de fluoruro de sodio.
4- Evaluar el proceso de absorción intestinal de fluoruro
5- Estudiar la expresión diferencial de proteínas en tejidos de las líneas de ratas ante la exposición a fluoruro.

En Argentina (Laboratorio de Biología Ósea, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Rosario[FCM-UNR]): se realizarán los trabajos con ratas y se realizarán medidas del proceso de remodelado óseo, de la estructura ósea (histomorfometría ósea trabecular y cortical), y resistencia ósea (medidas biomecánicas), función renal e intestinal. Se evaluará la resistencia a la insulina en función de los procesos mencionados anteriormente. Se obtendrán muestras de sangre, hígado, músculo y riñón para posteriores estudios proteómicos, siendo estas muestras trasladadas a Brasil donde se harán los estudios proteómicos correspondientes (en Bauru).
En Brasil (Cátedra de Bioquímica, Facultad de Odontología de Bauru, Universidad de San Pablo [FPB-USP]): se realizarán estudios similares con los ratones A/J y 129P3/J. Se realizarán los estudios proteómicos, y las medidas de resistencia a la insulina y funcionalidad renal e intestinal. Los fémures y las tibias se trasladarán a Argentina para los estudios estructurales y funcionales del tejido óseo.

Antecedentes de cooperación: los grupos de investigación de Brasil y Argentina involucrados en este proyecto compartieron durante 2011 y 2012 un convenio de cooperación internacional que permitió estudiar la resistencia a la insulina y su relación con la insuficiencia renal. En este trabajo se demostró que la ingesta crónica de fluoruro a través del agua de bebida, aunque no modifica la glucemia de ayuna en ratas, produce resistencia a la insulina tanto en ratas con insuficiencia renal crónica como en ratas normales. En un trabajo publicado en 2013, se verificó nuevamente el fenómeno descripto y se demostró que ratas sometidas a actividad física no presentan resistencia a la insulina.
El beneficio de la cooperación surge de la posibilidad de complementar estudios morfo-funcionales óseos, gastrointestinales y metabólicos con análisis proteómicos. La capacitación de los investigadores de Argentina en estudios proteómicos redundará en un crecimiento del grupo de investigación y la posibilidad de profundizar los estudios de la fluorosis en un campo que sería imposible con recursos propios.

Materiales y métodos
A continuación se hace una breve descripción de la metodología y se incluyen hipervínculos dentro del texto donde se describe en mayor profundidad los procedimientos y determinaciones.
Se tratarán ratas hembras de 21 días con fluoruro en el agua de bebida con una concentración de 20 ppm. El grupo control recibirá agua destilada como agua de bebida. Durante el experimento los animales serán mantenidos en jaulas colectivas hasta 5 animales/jaula. Las ratas recibirán alimento balanceado para ratas y agua ad libitum. La temperatura será mantenida a 23±1 ºC y con un ciclo luz/oscuridad de 12/12 h. Semanalmente se controlará el peso de los animales que será registrado en planillas de crecimiento, donde se comparará el crecimiento de cada animal con animales sanos de la misma edad y sexo. Se tomarán los percentilos 5 y 95% como límites aceptables de crecimiento.
Durante el tratamiento, que durará 30 días y cada 10 días se evaluará la función renal y la excreción urinaria de fluoruro. Para ello, los animales se colocarán en jaulas individuales y se recolectará orina por 24 h, en la que se medirá concentración de fluoruro por potenciometríoa directa y se determinará el clearance de creatinina por medida de excreción urinaria de creatinina y su valor en plasma.
La determinación de fluoruro se realizará en orina por potenciometría directa y cuando se mida en tejidos, plasma o hueso se realizará por potenciometría directa previa destilación isotérmica.

Cada 10 días se evaluará la resistencia a la insulina a través del índice HOMA-IR. Para calcular dicho índice se determinará glucemia e insulinemia en plasma en ayuno de 12 h. Para las determinaciones se utilizará plasma obtenido con heparina como anticoagulante, ya sea por punción cardíaca en el momento de la eutanasia o en capilares a partir de la vena de la cola. Por otra parte se evaluará la función del páncreas, hígado y tejidos en el metabolismo glucídico. Esta evaluación se hará utilizando un modelo matemático.
La evaluación del metabolismo óseo se realizará por medida de la captación y liberación de fluoruro del hueso, por medidas estructurales y biomecánicas. La liberación y captación de fluoruro óseo se realizará aplicando un modelo matemático descripto anteriormente.
La respuesta de la estructura ósea trabecular a los tratamientos con fluoruro se evaluará por histomorfometría estática a nivel de la metáfisis proximal de la tibia. Para este fin se realizarán cortes histológicos longitudinales teñidos con hematoxilina y eosina. Por su parte la respuesta estructural del hueso cortical se evaluará por medida de los diámetros externos e internos, el área cortical y el momento de inercia a nivel de la diáfisis de los fémures. Además se realizarán medidas funcionales de resistencia del tejido óseo a través de ensayos biomecánicos. Se realizarán dos tipos de ensayos biomecánicos: ensayo de flexión a tres puntos, que evalúa fundamentalmente la resistencia del hueso cortical y ensayo de compresión que evalúa el hueso trabecular.
Los estudios de absorción gastrointestinal de fluoruro se realizarán a través de medidas de balances de absorción neta de fluoruro y a través de estudios de absorción en estómago aislado in situ, intestino aislado in situ y asas intestinales aisladas.

Descripción de las técnicas utilizadas

Determinación de fluoruro por potenciometría directa
La medición de la concentración de fluoruro en orina se realizará por potenciometría directa utilizando un electrodo de ion específico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analógico digital. La determinación se basa en la relación lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentración de flúor en las muestras o patrones utilizados. Simultáneamente con las muestras se procesan soluciones patrones de NaF de 10-3 M- 10-6 M. A las muestras y las soluciones patrón se les adiciona un 10 % de buffer ácido acético/acetato de sodio 2 M para ajustar pH a 5-5.5 y homogeneizar la fuerza iónica de las soluciones. La técnica requiere muestras de orina de 50 ul o más.

Determinación de fluoruro por potenciometría directa post destilación isotérmica
La medición de la concentración de flúor en sangre, cenizas óseas y tejidos blandos se realizará por potenciometría directa utilizando un electrodo de ion específico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analógico digital. La determinación se basa en la relación lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentración de flúor en las muestras o patrones utilizados. Previo a la determinación potenciométrica el flúor será aislado de las muestras por destilación isotérmica, tratando la muestra con ácido fosfórico concentrado durante 24 h a 60 ° C y recuperando el ácido fluorhídrico desprendido de la muestra sobre 5 ul de NaOH 1.65 N depositado en la tapa de la cámara de destilación. Luego de la destilación isotérmica, la trampa de NaOH se ajusta a pH 5-5.5 l de ácido acético glacial diluído 1/120.mcon 60  Este procedimiento requiere muestras de plasma o suero de 20-100 ul y simultáneamente con las muestras se procesan testigos de NaF de concentraciones 10-3 M- 10-6 M.

Clearance de creatinina
El clearance de creatinina se calculará con las medidas de concentración de creatinina urinaria y plasmática y el valor de diuresis de 24 h. La determinación de creatinina plasmática y urinaria se realizará utilizando un kit comercial (Creatinina cinética AA, Wiener Laboratorios. Rosario. Argentina). Se determinará el cambio de absorbancia a 500 nm producido por la reacción de la creatinina con el picrato alcalino.

Determinación de insulina
La medida de la concentración de insulina plasmática se realizará con un contador de centelleo sólido Alfanuclear modelo Cmos utilizando un kit de radioinmunoensayo específico para insulina de rata (Rat insulin Millipore, USA). El ensayo se fundamenta en la competencia entre la insulina de la muestra con insulina marcada con 125I por anticuerpos específicos contra insulina de rata. El manejo del material radiactivo se realizará de acuerdo a las normas establecidas por la Autoridad Regulatoria Nuclear Argentina (norma ARN 10.1.1 de seguridad radiológica).

Determinación de glucosa plasmática
La determinación de glucosa se realizará con un kit comercial (Glicemia enzimática Wiener Laboratorios, Rosario, Argentina). El método utiliza glucosa oxidasa y el color desarrollado es proporcional a la concentración de glucosa en la muestra. La absorbancia se medirá a 505 nm con un espectrofotómetro Perkin Elmer, lambda 11 y se procesarán simultáneamente testigos de glucosa de 0.5, 1, 2 y 3 g/l.

Calculo de índice HOMA-IR
El índice HOMA-IR se calculará con la ecuación: Insulinemia en ayunas (uUI/ml) * Glucemia en ayunas (mmol/l) * 22.5.

Medida de captación y liberación de fluoruro del hueso.
La formación y resorción ósea se determinará aplicando un modelo matemático que utiliza los valores de fluoruria medidos en orina recolectada durante 24 h antes y 24 h después de la administración de 1 umol de NaF por vía endovenosa/100 g de peso corporal. Durante la medición las ratas se mantienen en jaulas metabólicas individuales con acceso a comida y agua ad libitum. Los valores de formación y resorción ósea se expresan en umol/l.min.

Obtención de cortes histológicos
Se obtendrán las tibias, se colocarán en formol 10% PBS, luego se descalcificarán en EDTA al 10% a 4ºC por 30 días. Pasado este período se procesarán de la manera convencional para la obtención de cortes histológicos coloreados con hematoxilina y eosina.

Medidas histomorfométricas
La determinación de los parámetros histomorfométricos óseos se realizará sobre una fotografía tomada a 40 aumentos en la metáfisis proximal de la tibia 1 mm del cartílago de crecimiento. En este sector se medirá el área total seleccionada (usualmente 2 mm2), el área ocupada con hueso y el perímetro del tejido óseo. Para dichas mediciones se utilizará el software ImageJ (NIH, USA). Con estos valores se calculará el porcentaje de hueso ocupado por tejido óseo (BV/TV), el grosor trabecular (Tb.Th), la separación trabecu lar (Tb.Sp) y el número de trabéculas (Tb.N) .

Ensayos biomecánicos
Se utilizará un instrumento para ensayos biomecánicos de flexión a tres puntos diseñado por el departamento de ingeniería del Laboratorio de Biología Ósea. El equipo cuenta con una celda de carga de 3 mV/V y 200 N de capacidad máxima, con sensibilidad de 0.01 N. El desplazamiento puede ser medido con una sensibilidad de 10 µm. Al someter el hueso a la acción de una fuerza se produce un desplazamiento que genera un voltaje que es proporcional a la fuerza aplicada. Los valores de voltaje y desplazamiento son adquiridos por un software de desarrollo propio (Biomedical data acquisition suite 1.0). El software transforma los datos de voltaje a fuerza y luego se procede al cálculo de las demás variables biomecánicas: fuerza de fractura (Fx), fuerza máxima soportada (Fmax), rigidez del hueso, energía absorbida, deformación (ω), stress (σ) y módulo de Young (Y).
En el ensayo de flexión a tres puntos el hueso se colocará en una posición horizontal y se aplicará una fuerza perpendicular a la diáfisis del mismo. La fuerza se ejercerá sobre el punto medio del fémur, de manera perpendicular y a una velocidad constante de 0.012 mm/s, hasta producirse su fractura.
Ensayo de compresión: Para el ensayo de compresión, se realizará un corte transversal de 2.5 mm de espesor de la epífisis distal utilizando una sierra circular diamantada de baja velocidad (IsoMet Buehler Ltd. Illinois, USA). El corte será sometido a una fuerza perpendicular progresiva en la zona trabecular, utilizando un accesorio con punta plana redonda de 2.5 mm de diámetro.

Medida del metabolismo glucídico
La funcionalidad hepática, renal, pancreática y de los tejidos dependientes e independientes de la insulina se evaluará a través de un modelo matemático que permite medir dichas funciones a través de datos de glucemia e insulinemia. Brevemente, el procedimiento consiste en estimar los parámetros que representan la secreción de insulina por el páncreas y eliminación de insulina del plasma, el consumo de glucosa por tejidos dependientes e independientes de insulina, el manejo hepático y gastrointestinal de glucosa. Luego de la estimación de los parámetros se realizará la optimización con el software Scilab. Estos parámetros serán utilizados en la comparación del metabolismo glucídico entre líneas de ratas.
La estimación de los parámetros se realizará a partir de datos de insulinemia y de glucemia obtenidos durante 6 h luego de la administración oral de una dosis de glucosa.

Estudios de absorción gastrointestinal de fluoruro

La absorción gastrointestinal neta se estudiará a través de experimentos de balance. A tal fin se colocarán los animales en jaulas metabólicas individuales, se controlará ingesta de fluoruro a través de agua y alimento, se recolectará materia fecal y se determinará fluoruro como se indicó anteriormente, en agua, alimento y heces. Se calculará la absorción neta de fluoruro con la siguiente ecuación
absorción neta= (fluoruro ingerido – fluoruro excretado)*100/fluoruro ingerido.
Esta medición da una medida de la absorción neta, pero no permite distinguir claramente el proceso de absorción del de secreción.
Se utilizarán además los modelos de estómago e intestino aislado in situ. Brevemente en estas metodologías, luego de anestesiar al animal, se realiza una laparotomía medial y se aísla estómago, por ligaduras a altura del cardias y del píloro o intestino por ligaduras a la altura del píloro y otra 4 cm en dirección distal. A través de un catéter se coloca una solución en la luz de la zona aislada y a intervalos de tiempos establecidos se obtienen muestras del contenido. El análisis de la concentración de fluoruro en las muestras obtenidas en función del tiempo permite evaluar la cinética del proceso de absorción. Ambos tipos de modelos de órganos aislados in situ permiten estudiar los procesos cinéticos de desaparición de una sustancia del lumen del órgano, utilizando muestras pequeñas (hasta 0.2 ml). En caso que se requieran volúmenes mayores del contenido de intestino se utilizarán el modelo de sacos intestinales evertidos, que permite mediciones instantáneas de variables en el contenido luminal.

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8. Rol de la fosfatasa alcalina en el mecanismo de absorción intestinal de calcio.

Integrantes: Dr. Lucas Brun, Med. Lorena Brance, Dr. Alfredo Rigalli.

Proyecto en colaboración con el Dr. Millán, Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, USA

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers.

Introducción

La absorción intestinal de calcio (Ca) es, como la de todos los nutrientes esenciales, una función que debe estar perfectamente conservada dado que es fundamental para el desarrollo normal de la masa ósea durante la niñez y la adolescencia, y su conservación en la edad adulta. Por otra parte, alteraciones en su absorción no sólo tienen relevancia en la osteoporosis, sino que también se asocian a desórdenes de la conducción nerviosa, de la contracción muscular, de los mecanismos de transducción de señales, etc. La osteoporosis es un problema de Salud Pública de relevancia a nivel mundial. Se caracteriza por una pérdida de masa ósea y aumento del riesgo de fractura, habitualmente asociada a una disminución de la absorción intestinal de Ca. Estudios realizados en Argentina revelan que 2 de cada 4 mujeres mayores de 50 años de edad tienen osteopenia y 1 de cada 4 tiene osteoporosis [1].
La fosfatasa alcalina intestinal (FAi) es una enzima de membrana del enterocito que aún no tiene un rol fisiológico definido. Su localización principalmente duodenal y el hecho de que su expresión esté regulada por la vitamina D al igual que las proteínas que participan en la absorción transcelular de Ca, hacen sospechar un rol en el metabolismo mineral y en especial con el mecanismo de absorción de Ca.
El Ca se absorbe a nivel intestinal por dos mecanismos principales: 1) Transcelular: activo, de importancia principalmente en duodeno, saturable y de alta eficacia a bajas concentraciones de Ca luminal, 2) Paracelular: pasivo, de importancia a lo largo de todo el intestino, no saturable y efectivo en yeyunoíleon por la longitud de este segmento [2]. En el mecanismo transcelular participan una serie de proteínas: a nivel del ribete en cepillo del enterocito los canales de Ca TRPV6, a nivel intracelular la calbindina D9k y en la membrana basolateral la bomba Ca-ATPasa (PMCA1b) y el intercambiador Na/Ca (NCX1) [3].
Está demostrado que no es suficiente el incremento de la cantidad de Ca en la dieta para lograr una mayor absorción. Superando 1 g de Ca/día en la dieta, la absorción normalmente no supera los 600 mg/día y se incrementa simultáneamente el Ca fecal [4]. El intestino parecería defenderse de las ingestas masivas de Ca mediante disminución de la fracción de absorción del catión.
La fosfatasa alcalina es una enzima de membrana con actividad de hidrolasa de ésteres monofosfóricos. Se conocen varias isoenzimas e isoformas: ósea, hepática, renal, intestinal, placentaria, etc. A nivel plasmático las isoformas ósea y hepática constituyen más del 95%. Para la isoenzima intestinal se han reportado dos genes en la rata que codificarían a FAi I, de ubicación a lo largo de todo el intestino, y FAi II, de ubicación predominante duodenal [5]. En humanos la expresión es primordialmente por el gen ALPI y en el ratón hay 3 isoenzimas expresadas por los genes Akp3 (intestinal), Akp5 (germinal) y Akp6 (placentaria) [6].
Se expresan a nivel intestinal con un máximo en duodeno y una disminución gradual a lo largo de todo el intestino. Es secretada tanto hacia la luz intestinal como hacia el plasma y su expresión  coincide con el canal de Ca TRPV6 en enterocitos maduros [7]. Es un homodímero de 180 kDa, de pI 4.5 y pH óptimo 9-9.5. Como se mencionó anteriormente es llamativo que al igual que las proteínas involucradas en el mecanismo de absorción de Ca, su expresión es regulada por vitamina D [3,8].
Hallazgos recientes involucran a la FAi en el proceso de absorción de grasas [9]. Ratones knock-out del gen de FAi presentaron mayor transporte y absorción de grasa y ganancia de peso acelerada. Sin embargo, esto no invalida la posible relación con la absorción de Ca.
Trabajos realizados en nuestro laboratorio demostraron interacción FAi-Ca con modificación de la actividad y estructura de la FAi [10]. Se halló que la FAi fija 8 iones Ca por molécula de proteína en sitios independientes y de igual afinidad [10]. Existe información sobre interacción Ca-fosfatasa alcalina en aves donde se reportó que a nivel intestinal existen dos isoenzimas, una Ca y otra magnesio dependiente [11]. Estudios histoquímicos con diferentes concentraciones de Ca in vivo, es decir con la enzima anclada a membrana, han demostrado un efecto estimulante del Ca sobre la enzima [12]. Experimentos con sacos intestinales evertidos en presencia de diferentes concentraciones de Ca luminal han demostrado cambios en el pH del contenido intestinal dependientes de la concentración de Ca luminal [13]. Dado que el canal TRPV6 es regulado por el pH [14], se plantea la hipótesis que la FAi podría estar actuando como sensor de la concentración de Ca luminal y regulador del ingreso masivo de Ca por modificación de la actividad del TRPV6. Empleando dietas conteniendo diferente concentración de Ca se encontró un incremento del porcentaje de absorción de Ca cuando la enzima fue inhibida con L-fenilalanina 16 mM en el agua de bebida [15]. Esto último indicaría participación de la FAi en la absorción de Ca, lo cual justifica la profundización en este campo de estudio.

Hipótesis de Trabajo

Alta ingesta de Ca en una situación donde la dieta fuera baja en Ca por varios días produciría la entrada de Ca al enterocito con potenciales efectos tóxicos. Por lo tanto es lógico suponer la presencia de un mecanismo de regulación de la entrada de Ca en la membrana apical independiente de la vitamina D, que frene el ingreso de Ca masivo desde el lumen intestinal.
Esta función podría esta a cargo de la FAi a través de modificación de su actividad por la concentración de Ca luminal. La hidrólisis de ésteres fosfóricos por la enzima produce ácido fosfórico y reduce la secreción de bicarbonato por los enterocitos [16,17] y por ende regula el pH. La actividad del canal TRPV6 y FAi podrían estar relacionadas a través del pH de la superficie duodenal ya que se sabe que el canal TRPV6 se inhibe por la disminución en el pH [18,19].

Objetivo General

Estudiar la absorción de Ca en ratones knock-out del gen Akp3 que codifica a la fosfatasa alcalina duodenal en comparación con ratones wildtype.

Objetivos Específicos

  1. Estudiar la captación y la absorción de Ca en ratones knock-out de fosfatasa alcalina duodenal en comparación con ratones wildtype alimentados previamente con dieta hipocálcica ante un cambio abrupto de la concentración luminal de Ca.
  2. Analizar la captación y la absorción de Ca en ratones knock-out de fosfatasa alcalina duodenal en comparación con ratones wildtype en ratones alimentados con dieta normocálcica.
  3. Analizar la histomorfometría duodenal en ratones knock-out de fosfatasa alcalina duodenal comparada con ratones wildtype.

Materiales y métodos    

Animales
Se utilizarán ratones C57BL/6 controles (wildtype) y knock-out (Akp3-/-) de fosfatasa alcalina duodenal. Los ratones fueron provistos por el Dr. José Luis Millán (julio 2010) del Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, USA, en el marco de un acuerdo institucional de transferencia de material biológico -MTA 11-315- con la Fac. Cs. Médicas - UNR.
Los ratones se mantienen en un ambiente climatizado, con periodo luz-oscuridad de 12 h y ciclos de ventilación cada 1 h. Todos los experimentos se llevarán a cabo acorde a las reglas internacionales de manejo de animales de laboratorio. La eutanasia se realizará bajo campana de CO2.

Se llevarán a cabo los siguientes experimentos:

- Estudiar la captación de Ca en enterocitos aislados en ratones FAi-KO y controles. Se obtendrá el duodeno para obtener enterocitos aislados y determinar la captación de Ca por los enterocitos empleando calcio radioactivo (45Ca). Se determinará la radioactividad de 45Ca en un contador de centelleo líquido (Beckman LS 100C, USA). También se determinará el porcentaje de absorción de Ca empleando el modelo de duodeno aislado in situ.

- Estudiar la captación de Ca en ratones KO de FAi en comparación con ratones WT alimentados con dieta hipocálcica ante un cambio abrupto de la concentración de calcio. Se obtendrá el duodeno de ratones KO y WT luego de recibir una dieta sintética conteniendo 0.2 g% de Ca durante 30 días. También se determinará el porcentaje de absorción de Ca empleando el modelo de duodeno aislado in situ.

- A partir de duodenos de ratones FAi-KO y WT alimentados con dieta normocálcica se evaluarán las características morfológicas del tejido duodenal en cortes histológicos coloreados con hematoxilina & eosina. Sobre las criptas se determinará: diámetro total, área total, área ocupada por células epiteliales de la cripta y altura celular. Mientras que sobre las vellosidades se determinará la altura, el diámetro, el  perímetro de cada vellosidad y el perímetro total de las vellosidades. La superficie de absorción se estimará con el perímetro total de las vellosidades. Las determinaciones se realizarán empleando el software Image J 1.40 (NIH, Maryland, USA).

Determinaciones bioquímicas

La calcemia, calciuria, fosfatemia y fosfaturia se medirán espectrofotométricamente por técnicas habituales (Wiener Lab). Los niveles de 25(OH) vitamina D se determinarán con un kit comercial por RIA (Diasorin). La concentración de Ca en materia fecal se determinará por espectroscopía de absorción atómica (Arolab MK IV).  Para la determinación de la actividad de la FA se empleará un equipo comercial que utiliza p-nitrofenilfosfato (pNFF) como sustrato a pH 9,8 en buffer dietanolamina (DEA) 1M, (Wiener Lab, Rosario, Argentina).

Enterocitos aislados

Aislamiento de células intestinales: El duodeno es separado, lavado con solución fisiológica y abierto longitudinalmente. Se corta en segmentos de 2 cm y se coloca en una solución 96 mM NaCl, 1,5 mM KCl, 8 mM KH2PO4, 5.6 mM Na2HPO4, 27 mM citrato de sodio, pH 7.3 (buffer A) por 10 minutos a 37 °C. Luego se cambia a solución 154 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1.5 mM EDTA, 0.5 mM ditiiotreitol, 5.6 mM glucosa, pH 7.3 (buffer B) por 15 minutos a 37 °C con agitación suave. Se centrifuga a 750 x g por 10 minutos para sedimentar la células, se lavan las células con buffer B sin EDTA y ditiotreitol. Luego las células se resuspenden en buffer 154 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na2HPO4, 1 mM MgCl2, 2.5 mM glutamina, 10 mM Mops, 5.6 mM glucosa, 1 mM CaCl2, 0.5% BSA, pH 7.3. Todos los pasos se realizan en atmósfera de carbógeno. La viabilidad de las células se analizará con Trypan blue. La exclusión del colorante por el 90% de las células o más por 90 minutos o más garantiza el funcionamiento de los enterocitos.

Captación de calcio: Una suspensión de células se equilibran 20 minutos con una solución conteniendo 140 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.4 y concentración variable de Ca2+ más alícuotas de 45Ca2+. A diferentes tiempos la captación de calcio se frena con la misma solución libre de calcio y en presencia de EGTA. La mezcla se centrifuga 1 minutos a 1500 x g, el pellet se resuspende en 1M NaOH 0,1% SDS y se determina el 45Ca.

Determinación de calcio radioactivo: La radiactividad de las muestras obtenidas se determina utilizando 45Ca (New England Nuclear, Research products, Boston, MA, USA) como marcador radiactivo, en un contador de centelleo líquido (Beckman LS 100C, USA) utilizando líquido de centelleo (Tolueno 0.65L, Alcohol Absoluto 0.35L, difeniloxazol 2.66 g). Se determinarán las cuentas por minuto (cpm) por el tiempo en que el error sea inferior al 2%. Se deja constancia que se dispone de una sala para trabajo con radioisótopos autorizado. La determinación plasmática de 45Ca puede ser dificultosa, por lo que se propone como alternativa la realización perfusión de intestino aislado in situ y concentración de las muestras por agregado de oxalato y precipitación como oxalato de calcio.

En el caso de hallar diferencias en la absorción de Ca se procederá a evaluar en los ratones knock out del gen Akp3 que codifica a la FAi el efecto de dicha ausencia sobre la estructura del tejido óseo. Se realizará densitometría ósea, determinación de minerales (Ca y P) en hueso, estudios biomecánica de flexión a 3 puntos sobre el fémur y estudios histomorfométricos para evaluar el tejido trabecular en tibia.

Referencias

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9. Desarrollo de un lácteo fortalecido con calcio, bajo contenido en lactosa y de preparación doméstica

Integrantes: Lic. Brenda Fina, Dr. Lucas R. Brun, Nicolas Dri, Hilda Moreno, Dr. Alfredo Rigalli

Introducción
La deficiencia de calcio (Ca) en la dieta es un problema que se acentúa en la adultez. La principal causa es la disminución en el consumo de leche por problemas digestivos derivados de la “no persistencia de lactasa o hipolactasia”, presente en 70% de la población mundial [1,2]. Normalmente se autodiagnóstica [3] y el tratamiento médico es la suspensión del consumo de lácteos. La principal consecuencia es la deficiencia de Ca y disminución de la densidad mineral ósea [4].
Está bien documentado que el consumo de leches fermentadas (yogurt, kefir, etc) es mejor aceptado entre personas con hipolactasia [5]. Se conocen diversos tipos de leches fermentadas con microorganismos que fermentan la lactosa y aportan a la leche un valor nutritivo mayor [6]. Ente ellos la leche de kefir, leche tratada con un conjunto de microorganismos productores de ácido láctico y dióxido de carbono conocidos como gránulos de kefir. El consumo de kefir redujo significativamente la intolerancia a la lactosa [7], predisponiendo al mayor consumo de lácteos [8]. Otras ventajas: mejores resultados en el tratamiento de ulceras gástricas [9], se halló asociado con menor prevalencia de caries [10], no promueve la desmineralización del esmalte dental [11], mejora el perfil lipídico, aumentado HDL y disminuyendo la relación colesterol/HDL colesterol [12].
La preparación de leche de kefir es fácil y segura, con escasa posibilidad de contaminación, pudiéndose preparar a partir de diferentes tipos de leches [13]. La estabilidad de los gránulos es alta, se pueden conservar a temperatura ambiente o heladera común [14,15] y su masa aumenta luego de cada fermentación siendo poco afectada por condiciones ambientales y químicas [16].La disposición de los microorganismo en el gránulo le otorgan un gran poder antimicrobiano [17]. El tratamiento de leche con kefir produce hidrólisis parcial de las caseínas y la alfa-lactoalbúmina [18].
Evaluaciones realizadas por nuestro laboratorio en julio de 2012 indican que el aporte de calcio diario a partir de leche tiene un costo de 5 $/día o mayor si se utilizan quesos. Mientras que el mismo aporte de calcio a partir de leches fermentadas de origen comercial ascendería a 20$/día. La preparación doméstica de leche fermentada con enriquecimiento con calcio proveniente de la cáscara de huevo podría llevar este costo a 2.5$/día.

Objetivo general
Desarrollar un lácteo de bajo contenido de lactosa, con adición de calcio proveniente de la cáscara de huevo y de preparación doméstica

Objetivos específico
1- Establecer las condiciones (estado, tiempo, etc) para lograr la incorporación de calcio a partir de la cáscara de huevo a la leche tratada con kefir para lograr su completa disolución
2- Establecer la cantidad óptima de cáscara de huevo necesaria para lograr el enriquecimiento en calcio en la leche.
3- Evaluar el contenido de lactosa de la preparación.
4- Evaluar el contenido proteico de la preparación.
3- Evaluar textura y sabor del preparado luego de su proceso de fermentación.
4- Evaluar la biodisponibilidad de calcio del preparado obtenido.

Materiales y métodos
En todos los trabajos que se detallan las determinaciones se ejecutarán siguiendo protocolos operacionales estandarizados descriptos en el laboratorio. Las determinaciones se llevarán a cabo bajo control de calidad, rechazando los valores medidos si el coeficiente de variación supera el 10%. Todos los equipos utilizados están sometidos a controles periódicos de funcionamiento y con registro de dichos controles.
A continuación se describe brevemente la metodología para cumplir con cada objetivo específico

Objetivo específico 1
Establecer las condiciones (temperatura, tiempo, etc) para lograr la incorporación de calcio a partir de la cáscara de huevo a la leche tratada con kefir para lograr su completa disolución

Para cumplir con este objetivo se utilizará cáscara de huevo en polvo y se adicionará a leche en presencia de gránulos de kefir. La masa de kefir y de cáscara de huevo será determinada previamente a la mezcla con balanzas analíticas. La mezcla se mantendrá a temperatura controlada y se obtendrán alícuotas a lo largo del tiempo hasta lograr la coagulación de la mezcla. Se determinará pH, concentración de calcio en la fracción soluble y en el residuo insoluble (constituido principalmente por cáscara no disuelta). Se reservarán muestras para la determinación de lactosa. A continuación se describen brevemente las determinaciones a realizar
Determinación de calcio: Se realizará por espectrofotometría de absorción atómica (Arolab MK II). Las muestras se diluyen en una solución de cloruro de estroncio al 2% para eliminar interferencias por aniones que complejan el calcio. Un volumen de esta solución se volatiliza en una llama acetileno-oxígeno y se mide la absorbancia que la misma tiene sobre luz proveniente de una lámpara de calcio. La concentración de calcio en la muestra se determina por la comparación con soluciones patrones de calcio procesados de la misma manera.
Determinación de pH: se realizará con pH Methrom 632 calibrado para el rango 4-7, dada la característica de la muestra
Determinación de masas: se realizará con balanza analítica Mettler sensibilidad 0.1 mg

Objetivo específico 2
Establecer la cantidad óptima de cáscara de huevo necesaria para lograr el enriquecimiento en calcio en la leche.
Cumplido con el objetivo 1 y hallada las condiciones óptimas para lograr la incorporación de calcio se procederá a hallar la cantidad adecuada de cáscara para lograr un enriquecimiento en calcio que logre una incorporación significativa de calcio como para cubrir los requerimientos diarios de calcio, utilizando un volumen de leche de kefir adecuado. La leche tiene aproximadamente 1 g de calcio por litro. Se pretende en este proyecto alcanzar un preparado que contenga 2 g calcio/litro, de manera que el requerimiento diario pueda ser provisto por medio litro de esta bebida.
Para cumplir con este objetivo se realizarán incubaciones con diferentes cantidades de cáscara de huevo y kefir en cantidad contaste. Alcanzado el tiempo óptimo de incubación determinado en el objetivo 1, se determinará calcio en la fracción soluble.

Objetivo específico 3
Evaluar el contenido de lactosa de la leche de kefir obtenida
Se utilizará la determinación de glucosa utilizando un kit comercial (wiener laboratorios, rosario) luego del tratamiento con beta-galactosidasa (lactasa). El contenido de lactosa se determina por diferencia entre el valor medido antes y despues del tratamiento con lactasa. Como método de referencia y control se utilizará el descripto en FIL-28:1964 de la Federación Internacional de Lechería.

Objetivo específico 4
Evaluar el contenido proteico de la preparación.
La determinación de proteínas totales se realizará utilizando un kit comercial (Proti 2, Wiener Laboratorios, Rosario, Argentina)

Objetivo específico 5
Evaluar textura y sabor del preparado luego de su proceso de fermentación.
La evaluación será controlada por un chef profesional, parte de este proyecto. Para ello se prepararán leches de kefir con las condiciones óptimas establecidas en los objetivos previos , en las que se utilizará cáscara de huevo esterilizada en autoclave. El ensayo se realizará a doble ciego y cada individuo consumirá dos muestras de leche tratadas con gránulos de kefir, salvo que una de ellas tendrá el enriquecimiento en calcio. El chef realizará preguntas sobre textura y sabor al individuo. El chef y el individuo que consume no conocerán si las muestras continen o no la adición. Las muestras serán numeradas y preparadas por un integrante del proyecto que no participará en el ensayo.
El ensayo se llevará a cabo con personas pertenecientes al laboratorio de biología ósea, quienes conocerán a priori la característica del ensayo.

Objetivo específico 6
Evaluar la biodisponibilidad de calcio del preparado obtenido.
Se realizarán experimentos con ratas Sprague Dawley adultos. Los animales serán alojados en jaulas metabólicas individuales alimentados con agua ad libitum y recibirán diariamente por vía orogástrica preparación de kefir adicionada con cáscara de huevo. El grupo control serán animales de la misma línea y edad que recibirán la misma cantidad de calcio pero en la forma de carbonato de calcio (que es la forma habitual de administración como comprimido)
El tratamiento de los animales se realizará de acuerdo a las normas internacionales de cuidado y trabajo con animales.
Se recolectarán las heces para determinar la absorción neta del catión. A partir de los datos obtenidos diariamente se calculará empleando las siguientes fórmulas 1) Absorción neta de calcio = calcio total ingerido - calcio excretado en heces y 2) Porcentaje aparente de absorción de calcio = [(calcio total ingerido - calcio excretado en heces) x 100] / calcio total ingerido. El calcio se determinará por espectrofotometría de absorción atómica (ver determinación de calcio).
De no ser concluyentes los experimentos in vivo detallados en el párrafo anterior, se realizarán experimentos de intestino aislado in situ. Las ratas serán anestesiadas, mantenidas en camillas termostatizadas, con temperatura ambiente 21-22º C. Se aislarán 6 cm del duodeno in situ mediante dos ligaduras, la primera a nivel del píloro. En el extremo distal se colocará un catéter, a través del cual se introducirá la solución a investigar y se obtendrán muestras del contenido luminal. La solución a investigar contendrá trazas de calcio radioactivo (45Ca2+) el cual será utilizado para determinar la absorción del catión. La determinación de radioactividad del 45Ca2+ se realizará utilizando un contador de centelleo líquido Beckman LS 100C. En cada muestra se determinaron las cpm con un error menor al 2%. Se tomarán muestras de sangre por la vena de la cola a diferentes tiempos (0, 5, 10, 15 y 20 minutos) para determinar la calcemia por espectrofotometría de luz visible (ver determinación de calcio). El laboratorio cuenta con cuarto autorizado por Autoridad Regulatoria Nuclear para el manejo de Ca45.

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10. Evaluación de la tolerancia y la absorción gastrointestinal de calcio en voluntarios humanos de un lácteo de bajo contenido de lactosa enriquecido con calcio.

Integrantes: Lic. Brenda Fina, Dr. Lucas Brun, Dr. Alfredo Rigalli

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers.

Introducción

La deficiencia de calcio (Ca) en la dieta es un problema que se acentúa en la adultez. La principal causa es la disminución en el consumo de leche por problemas digestivos derivados de la “no persistencia de lactasa o hipolactasia”, presente en 70% de la población mundial. Normalmente se autodiagnóstica y el tratamiento médico es la suspensión del consumo de lácteos. La principal consecuencia es la deficiencia de Ca y disminución de la densidad mineral ósea.
Está bien documentado que el consumo de leches fermentadas (yogurt, kefir, etc) es mejor aceptado entre personas con hipolactasia. Se conocen diversos tipos de leches fermentadas con microorganismos que fermentan la lactosa y aportan a la leche un valor nutritivo mayor. Ente ellos la leche de kefir, leche tratada con un conjunto de microorganismos productores de ácido láctico y dióxido de carbono conocidos como gránulos de kefir. El consumo de kefir redujo significativamente la intolerancia a la lactosa, predisponiendo al mayor consumo de lácteos. Otras ventajas: mejores resultados en el tratamiento de ulceras gástricas, se halló asociado con menor prevalencia de caries, no promueve la desmineralización del esmalte dental, mejora el perfil lipídico, aumentado HDL y disminuyendo la relación colesterol/HDL colesterol.
La preparación de leche de kefir es fácil y segura, con escasa posibilidad de contaminación, pudiéndose preparar a partir de diferentes tipos de leches. La estabilidad de los gránulos es alta, se pueden conservar a temperatura ambiente o heladera común y su masa aumenta luego de cada fermentación siendo poco afectada por condiciones ambientales y químicas.La disposición de los microorganismo en el gránulo le otorgan un gran poder antimicrobiano. El tratamiento de leche con kefir produce hidrólisis parcial de las caseínas y la alfa-lactoalbúmina.
Evaluaciones realizadas por nuestro laboratorio en julio de 2012 indican que el aporte de calcio diario a partir de leche tiene un costo de 5 $/día o mayor si se utilizan quesos. Mientras que el mismo aporte de calcio a partir de leches fermentadas de origen comercial ascendería a 20$/día. La preparación doméstica de leche fermentada con enriquecimiento con calcio proveniente de la cáscara de huevo podría llevar este costo a 2.5$/día.
La cáscara de huevo es una fuente natural de calcio y es desechada como residuo. Una cáscara de huevo contiene aproximadamente 2 g de calcio por cáscara y ese calcio presenta similar biodisponibilidad comparado con el carbonato de calcio que se encuentra en los comprimidos.

Objetivos

1- Evaluar la tolerancia y palatabilidad de un lácteo de producción hogareña con alto contenido de calcio y bajo de lactosa.
2- Evaluar la biodisponibilidad de calcio a partir del lácteo mencionado.

Materiales y métodos

El trabajo se desarrollará en 20 voluntarios sanos entre 20 y 55 años, miembros del laboratorio donde se ejecutará el proyecto. Los voluntarios deberán leer y firmar un consentimiento informado indicando las características de la prueba, sus resultados e implicancias. El consumo del lácteo no tiene contraindicaciones, ya que se utiliza leche, gránulos de kefir y cáscara de huevo esterilizada como fuente de calcio. Se preparará leche fermentada con kefir y adicionada con cáscara de huevo. La cáscara de huevo, fuente de carbonato de calcio será esterilizada en autoclave a 131ºC por 15 20 min. La fermentación de la leche por el kefir se realizará durante 24 h a 8 ºC. Pasado este período se filtrará para eliminar restos de cáscara y gránulos de kefir, los que serán reutilizados para futuras fermentaciones.
Se guardarán muestras de cada una de las preparaciones para su posterior medición del contenido de calcio y lactosa.
El test de tolerancia y palatabilidad se realizará evaluando la presencia de síntomas gastrointestinales (si lo hubiera) como náuseas, diarrea, vómitos, etc. Cabe destacar que los voluntarios serán personas sanas que consumen lácteos habitualmente sin manifestaciones de hipolactasia.
La biodisponibilidad se medirá por determinación de la excreción urinaria de calcio luego de la ingesta de un volumen de leche o la misma leche tratada con kefir y cáscara de huevo. Se utilizará un modelo aleatorizado cruzado a doble ciego. Cada individuo recibirá un mismo volumen de leche, leche tratada con kefir o leche tratada con kefir más cáscara de huevo con 7 días de separación entre las pruebas. Se recolectará orina durante 24 h y se determinará la concentración de calcio por absorción atómica. Para el cálculo de la excreción diaria se utilizará la diuresis y la concentración de calcio.
Los resultados se compararán utilizando con el test de Friedman y las diferencias se considerarán significativas si p<0,01.
La medida de calcio en orina y en preparados lácteos se realizará utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica AROLAB MKII con llama de acetileno:oxígeno, utilizando soluciones patrón de calcio de 1-100 ug/ml. La lactosa en el lácteo se determinará a través del contenido de glucosa, luego de producir la hidrólisis en medio ácido a 100ºC

Posibles aportes del Proyecto

Se estima que un 70% de la población adulta padece de no persistencia de lactasa intestinal, que conduce a disminución del consumo de lácteos debido a los disturbios gastrointestinales y como consecuencia a una disminución de la densidad mineral ósea. En trabajos anteriores se evaluó la leche fermentada con gránulos de kefir, demostrándose que la misma tiene aproximadamente un 50% de lactosa y el doble de calcio que la leche utilizada para su preparación. Este proyecto propone evaluar la tolerancia, palatabilidad y la absorción de calcio en voluntarios sanos. Dado que los gránulos de kefir son de uso común en algunas poblaciones y los productos utilizados no involucran fármacos, los resultados de estos experimentos serían de utilidad para profesionales que necesiten realizar recomendaciones dietarias a sus pacientes, recurriendo a una práctica hogareña de fácil manejo por el paciente y sin riesgo alguno. El desarrollo de un lácteo enriquecido en calcio de buena digestibilidad es una solución a un problema de salud pública que se resolvería sin gastos extra en medicamentos.

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11. Efecto de la yerba mate sobre el tejido óseo

Integrantes: Dr. Lucas Brun, Méd. Lorena Brance, Cielo Maher, Dra. Verónica Di Loreto, Dr. Alfredo Rigalli

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers.

Introducción

El consumo de yerba mate (Ilex paraguariensis) en la Argentina y otros países de América del Sur es habitual. El consumo más alto se produce en Uruguay (6-8 Kg/persona/año) y Argentina (5 Kg/persona/año) [Bracesco N, 2011]. Previamente se han demostrado varios efectos de la yerba mate:

  • Efectos sobre el metabolismo lipídico: Se demostró reducción en el contenido de colesterol y el tamaño de las lesiones aórticas en conejos alimentados con una dieta enriquecida en colesterol [Mosimann AL, 2006]. También se ha demostrado una mejoría en el perfil lipídico en pacientes dislipémicos [de Morais EC, 2009].
  • Efecto sobre el peso corporal: Se ha demostrado inhibición de la actividad de la lipasa pancreática in vitro. Además, algunos estudios han demostrado que los ratones que recibieron el extracto de Ilex paraguariensis y dietas ricas en lípidos aumentan menos de peso que los controles [Arçari DP, 2009].
  • Efectos anti-inflamatorio e inmunomodulador: inhibición de factores pro-inflamatorios (COX-2, oxido nítrico, PEG 2, IL-1, IL6), reducción de LPS inducido por la translocación nuclear del factor nuclear kappa B subunidades, inhibición de la elastasa de neutrófilos humanos [Bracesco N, 2011].
  • Propiedades antifúngica sobre Malassezia furfur [Filip R, 2010].
  • Propiedades angiogénicas [Bracesco N, 2011].

5. Asociación controvertida con cáncer orofaríngeo dado que estaría relacionada al agua caliente y no a la bebida en sí [Ramirez-Mares MV, 2004]. 
El mate constituye la fuente de ingreso más importante (50%) de cafeína ya que si bien el contenido de cafeína es menor que el del café, el consumo de yerba mate es superior al de café. El efecto negativo de la cafeína se observó principalmente en dietas con bajo contenido de calcio [Ilich JZ, 2002]. Dado que la cafeína ha demostrado tener un impacto negativo sobre la densidad mineral ósea y el riesgo de fractura [Kiel DP, 1990; Harris SS 1994] se podría esperar un efecto negativo de la yerba mate sobre el hueso. Sin embargo, un trabajo recientemente publicado [Conforti AS  2012] mostró, en mujeres postmenopáusicas tomadoras de mate, una mayor densidad mineral ósea (DMO) en columna vertebral y cuello femoral. Dado que este trabajo solo demostró un aumento de la DMO, este proyecto tiene como objetivo conocer el efecto de la yerba mate sobre diferentes parámetros óseos.

El objetivo general de este proyecto es estudiar el efecto de la yerba mate sobre el tejido óseo.

Como objetivos específicos se plantea evaluar el efecto de la yerba mate sobre:

- la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo,
- el tejido óseo cortical,
- el tejido óseo trabecular,
- la absorción intestinal de calcio.

Materiales y Métodos

Se emplearán ratas Sprague Dawley hembras de 30 días (n=24) se dividirán en 4 grupos: Control dieta hipocálcica (0.2%), control dieta normocálcica (1%), yerba dieta hipocálcica (0.2%), yerba dieta normocálcica (1%). Como yerba mate se empleará mate cocido (25 g de yerba mate en 1 litros de agua a 90ºC) ad libitum. El mate cocido se administrará a partir del día 30 por 60 días. Finalizado el experimento se sacrificarán los animales y se obtendrán los huesos para realizar los siguientes estudios:

Histología e histomorfometría: La tibia izquierda se fijará con formol-PBS al 10% durante 72 horas y posteriormente se descalcificará en EDTA 10% por 30 días. Se incluirá en parafina y se realizarán cortes histológicos con tinción de hematoxilina-eosina.

Se procederá a la digitalización de las imágenes obtenidas de los preparados histológicos mediante un microscopio (Olympus) con una cámara fotográfica adaptada (Olympus SP-350, China). Se tomarán fotografías a 4x de la epífisis proximal de la tibia a fin de evaluar el hueso trabecular en un área de 2 mm2 a 1 mm del cartílago de crecimiento. Esta imagen será recortada y posteriormente analizada con un software específico (ImageJ 1.40 (NIH, Maryland, USA). Se determinará, el área total de tejido analizado: TV (μm2);  área ocupada por hueso: BV (μm2);  y perímetro de dicha área: BS (μm). Con estos valores se calcularán: A. Porcentaje de tejido óseo: BV/TV (%). B. Grosor trabecular: Tb.Th (mm) = [2/(BS/BV)]. C. Número de trabéculas: Tb.N (1/mm) = [(BV/TV)/(Tb.Th)]. D. Separación trabecular: Tb.Sp (mm) = [(1/Tb.N)-Tb.Th]. 

Morfometría cortical: Se realizarán cortes transversales de 1 mm al 50% de la tibia sin descalcificar utilizando una sierra de baja velocidad (IsoMet. Buehler Ltd. Illinois. USA). Se realizarán las mediciones con el software ImageJ 1.40 de: área de corte, área cortical, área medular, perímetro perióstico, perímetro endóstico, diámetro total, diámetro medular y grosor cortical.

Evaluación de  la resistencia ósea: La evaluación de la resistencia ósea se realizará en los fémures a través de dos ensayos: ensayo de flexión a tres puntos a nivel de la diáfisis para medir la resistencia del hueso cortical y ensayo de compresión a nivel de la epífisis para medir la resistencia del hueso trabecular. Al someter al hueso a la acción de una fuerza se produce un desplazamiento y la fuerza aplicada genera un voltaje que es proporcional a la fuerza. El software transforma los datos de voltaje a fuerza y luego se procede al cálculo de las demás variables biomecánicas: fuerza de fractura, fuerza máxima soportada, rigidez del hueso, energía absorbida, deformación, tensión y módulo de Young.

Evaluación de la densidad mineral ósea y contenido mineral óseo: De las tibias se obtendrá una radiografía con un equipo de rayos X de 70KV simultáneamente con un patrón de aluminio el cual está calibrado con concentraciones de calcio conocidas. Se estimará densidad mineral ósea y contenido mineral óseo empleando el software ImageJ 1.40.

Evaluación de la absorción de calcio: A los 0, 30 y 90 días se colocarán las ratas en jaulas individuales para realizar balances de calcio y obtener el porcentaje de absorción de calcio. El porcentaje de absorción de Ca se obtendrá por cálculo utilizando los valores de Ca ingerido y excretado por materia fecal: %Ca = (24-h Ca ingerido – 24-h Ca excretado en materia fecal) x 100 / 24-h Ca ingerido. El calcio ingerido se calculará por la diferencia de la cantidad de alimento administrado y el sobrante a las 24 de horas. En materia fecal el calcio se determinará por absorción atómica (Arolab MK II, BsAs, Argentina). Finalizado el experimento se aislaran enterocitos para determinar captación de calcio.

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12. Efecto del fluoruro sobre la cinetica del cartilago de crecimiento y el hueso subcondral de ratas

Integrantes: Lic. Brenda Fina, Med. Stella Roma, Florencia Bues, Dra. Verónica Di Loreto

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers.

Introducción
En los mamíferos, el crecimiento longitudinal de los huesos se lleva a cabo por el proceso de osificación endocondral. El disco epifisiario de crecimiento o cartílago de crecimiento es una estructura altamente especializada responsable de este crecimiento longitudinal. El proceso de formación de hueso endocondral consiste en el proceso sincronizado de condrogénesis y la deosificación del cartílago. Los condrocitos del cartílago de crecimiento proliferan, se hipertrofian y secretan matriz lo cual lleva a la formación de nuevo cartílago. Luego los condrocitos terminales sufren apoptosis, hay invasión por nuevos vasos sanguíneos y ocurre el remodelado del cartílago y la formación de nuevo hueso.
Factores que afecten el desarrollo y maduración de estos procesos pueden eventualmente llevar a disturbios en el crecimiento óseo.
El fluoruro (F) ha sido motivo de controversia para el consumo humano desde hace mucho tiempo.  Inicialmente se pensó que una cantidad mínima de F era necesaria para una buena fortaleza ósea y dental, pero experimentos posteriores demostraron que el consumo crónico de F podría derivar a un hueso más desorganizado y menos resistente [Gupta SK, 2009]. Las fuentes de F incluyen las aguas fluoradas, alimentos, pastas dentífricas, enjuagues bucales y medicamentos. En especial los niños son una población expuesta al F no solo por consumo de aguas fluoradas sino también por ingestión de pastas dentífricas: el 81.5 % de la ingesta promedio diaria de F proviene de este producto [Buzalaf M, 2007]. Cuando el F se consume crónicamente en concentraciones más elevadas que las permitidas por la OMS, puede producirse fluorosis, una enfermedad que afecta a millones de personas en diversos países del mundo. En Argentina no alcanza la gravedad de países como China e India, sin embargo, se ha observado  algunas alteraciones metabólicas y óseas en habitantes de zonas con alto contenido de flúor en agua potable [De la Sota M, 1997; Menoyo I, 2008]. Se ha observado también que el F produce apoptosis en células de distintos tejidos incluyendo células óseas [Yang S, 2011] y también suprime su proliferación [Wang Z, 2011].
Los efectos del F sobre el hueso esponjoso secundario han sido ampliamente estudiados, sin embargo, el conocimiento sobre cómo este ión puede afectar cartílago de crecimiento y hueso esponjoso primario, derivado de él, es muy limitado.
Al respecto, existen muy pocos trabajos que evalúen los efectos del F sobre cartílago de crecimiento. Estudios realizados sobre cóndilo mandibular de ratas con exposición crónica al F mostraron aumento del grosor del cartílago debido al incremento del número y tamaño de las células de la zona hipertrófica del cartílago [Kameyama Y, 1974; Harbrow DJ, 1992]. Estudios realizados por Yesildag et al [2004] con altas dosis de F sobre el fémur de ratas en crecimiento demostraron alteraciones en el cartílago de crecimiento y el hueso esponjoso primario así como retardo en la fusión del cartílago de crecimiento. Sin embargo, no está claro qué implicaciones tienen estos hallazgos en el crecimiento óseo ni por qué mecanismo actuaría el F. Nuestra hipótesis se basa en que el F podría producir una alteración en la cinética de los condrocitos en el cartílago de crecimiento, es decir, entre el balance entre su proliferación celular y su muerte celular, y, de esta manera, afectar el crecimiento óseo.
Por lo tanto, nuestro objetivo es estudiar los efectos del F sobre la cinética de los condrocitos en el cartílago de crecimiento y sobre el hueso subcondral (esponjoso primario) de ratas en crecimiento por técnicas histológicas e inmunohistoquímicas.

Teniendo en cuenta que el crecimiento endocondral y la osificación, los procesos por los cuales el cartílago incrementa su tamaño y es reemplazado por hueso, pueden ser afectados por agentes químicos, este proyecto tiene como objetivo:
Estudiar los efectos del fluoruro sobre la cinética de los condrocitos en el cartílago de crecimiento y sobre el hueso subcondral de ratas en crecimiento por métodos histológicos e inmunohistoquímicos

Materiales y métodos

Se utilizarán ratas Sprague-Dawley de 21 días de edad a las cuales se les administrará diariamente NaF a distintas dosis (0-80 umol/día/100 g peso corporal) en el agua de bebida durante 30 días. Al finalizar el período de tratamiento se efectuará la eutanasia por inhalación en cámara de dióxido de carbono. Se les extraerá la tibia derecha y se medirá su longitud con un calibre. Luego, se fijarán en formol-buffer fosfato al 10%. Posteriormente se descalcificarán con EDTA al 10% y serán embebidas en parafina. Se realizarán cortes longitudinales de 5μm de espesor con un micrótomo (Leitz Wetzlab, German). Dichos cortes se teñirán con hematoxilina-eosina.
Todos los experimentos se llevarán a cabo siguiendo las normas internacionales de cuidado y uso de animales de laboratorio [www.ccac.ca].

Estudios histopatológicos: Serán realizados sobre los preparados en la zona de la tibia proximal. Se estudiarán el disco epifisiario de crecimiento y del hueso subcondral. Respecto al cartílago, se evaluará la estructura de las columnas y la morfología de los condrocitos en las zonas hiperplásica e hipertrófica del disco epifisiario.
En el hueso subcondral,  se analizará la disposición, conectividad trabecular, relación con el tejido hematopoyético y celularidad del tejido óseo. Este análisis se llevará a cabo a una distancia de hasta 1 mm distal al borde inferior del disco epifisiario.

Estudios histomorfométricos: Para la realización de las medidas histomorfométricas se efectuarán fotografías de los preparados histológicos de las tibias con una cámara digital (Olympus) adaptada a un microscopio (Olympus). Se determinarán parámetros histomorfométricos estáticos a nivel del hueso esponjoso primario de la tibia proximal: volumen de tejido total (TV), volumen óseo trabecular (BV), superficie ósea trabecular (BS). Con estos valores, se calcularán el porcentaje de volumen de hueso trabecular (%BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th), número de trabéculas (Tb.N) y separación de las trabéculas (Tb.Sp) [Parfit, 1997]. Las medidas se llevarán a cabo a una distancia de hasta 1mm distal al borde inferior del disco epifisiario y en un área de 2 mm2 sobre las imágenes digitalizadas. A nivel del disco epifisiario de crecimiento se medirán el espesor de la  zona hiperplásica, el espesor de la zona hipertrófica y el espesor total del disco epifisiario [Smith EJ, 2005].
Todas las mediciones se realizarán con el programa Image J 1.40 (Nacional Institutes of Health, Maryland, USA).

Estudios inmunohistoquímicos: serán realizados sobre el material incluido en parafina. Para la visualización in situ de células apoptóticas utilizaremos la técnica TUNEL (terminal transferase-ADN mediated dUTP nick-end labeling) empleando el kit comercial ApopTag Plus peroxidase in situ apoptosis detection kit (EMD Millipore, USA). La proliferación celular será detectada por inmunotinción para el marcador de proliferación celular ki-67 utilizando anticuerpo monoclonal de conejo anti ki-67 (Chemicon International, USA).

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13. Efectos de drogas osteotrópicas sobre cartílago de crecimiento y hueso subcondral de ratas

Integrantes: Lic. Brenda Fina, Lic. Patricia Lupion, Dra. Verónica Di Loreto

Introducción
El crecimiento, mantenimiento y función del hueso depende fundamentalmente de los procesos de modelado y remodelado. Las drogas osteotrópicas son capaces de modificar directa o indirectamente los procesos mencionados.
Los bisfosfonatos (BP) son drogas antirresortivas ampliamente utilizadas en la práctica clínica para tratamiento de distintas enfermedades óseas tanto en adultos como en pacientes pediátricos.Estos compuestos se unen al mineral óseo e inhiben la resorción ósea actuando sobre los osteoclastos. Estas células están involucradas tanto en la resorción del cartílago calcificado como del hueso subcondral.
El anión fluoruro (F) es una sustancia con efecto anabólico sobre el hueso. Normalmente ingresa al organismo por medio de aguas fluoradas, alimentos, pastas dentífricas, enjuagues bucales y medicamentos.

Teniendo en cuenta que el crecimiento endocondral y la osificación, los procesos por los cuales el cartílago incrementa su tamaño y es reemplazado por hueso, pueden ser afectados por agentes químicos, este proyecto tiene como objetivo general el estudio histológico e histomorfométrico del cartílago de crecimiento y hueso subcondral de tibias de ratas tratadas con drogas osteotrópicas y en diferentes estados metabólicos del hueso.

Objetivos particulares:
Sobre el cartílago de crecimiento y el tejido óseo subcondral se evaluará histológica e histomorfométricamente:
1) el efecto del fluoruro de sodio a diferentes dosis en ratas en crecimiento
2) el efecto del ácido zoledrónico a diferentes dosis en ratas en crecimiento
3) el efecto del tratamiento con ácido zoledrónico solo y en combinación con una droga anabólica sobre ratas osteopénicas que no alcanzaron la madurez esquelética

METODOLOGÍA
Se describe de manera breve el diseño experimental para cada objetivo particular. Todos los experimentos serán realizados siguiendo las normas internacionales de cuidado y uso de animales de laboratorio.

1) Estudiar el efecto del fluoruro de sodio sobre el cartílago de crecimiento y el tejido óseo subcondral de ratas en crecimiento. Se utilizarán ratas Sprague-Dawley de 21 días de edad a las cuales se les administrará diariamente NaF a distintas dosis (0-80 umol/día/100 g peso corporal, vía orogástrica) durante 30 días. Al finalizar el período de tratamiento se efectuará la eutanasia, se extraerán las tibias y se realizarán los estudios histopatológicos e histomorfométricos.

2) Evaluar el efecto del ácido zoledrónico sobre el cartílago de crecimiento y el tejido óseo subcondral de ratas en crecimiento. Se utilizarán ratas Sprague-Dawley de 21 días de edad a las cuales se les administrará ácido zoledrónico (AZ) a distintas dosis (vía subcutánea, 0-6 ug/kg peso corporal, vía subcutánea). Luego de 30 días de tratamiento se realizará la eutanasia y se obtendrán las tibias sobre las cuales se realizarán los estudios histopatológicos e histomorfométricos.

3)  Evaluar si existen alteraciones histológicas a nivel del cartílago de crecimiento y hueso subcondral de ratas  osteopénicas, sin madurez esquelética y tratadas con ácido zoledrónico solo y en combinación con una droga anabólica. Para la realización de este objetivo, el estudio del disco epifisiario de crecimiento y hueso subcondral se llevará a cabo utilizando cortes histológicos obtenidos en experimentos realizados previamente en nuestro laboratorio y que fueron utilizados para evaluar histomorfométricamente hueso esponjoso secundario pero no hueso subcondral primario ni cartílago. Además en estos animales se estudiaron otros parámetros óseos como densitometría ósea, biomecánica y estudios a nivel de hueso cortical.
El protocolo utilizado fue el siguiente: a los animales se les realizó ovariectomía bilateral para inducirles osteopenia y fueron tratados durante un mes con AZ solo y combinado con monofluorofosfato de sodio (MFP). Otro grupo de ratas fueron tratadas de manera secuencial con MFP y AZ.

Metodología común a los objetivos 1 y 2:
Luego de 30 días de tratamiento se practicará la eutanasia de los animales por inyección intracardíaca de KCl bajo profunda anestesia. Se les extraerá la tibia derecha y se fijarán en formol-buffer fosfato al 10%. Posteriormente se descalcificarán con EDTA al 10% y serán embebidas en parafina. Se realizarán cortes longitudinales de 5μm de espesor con un micrótomo (Leitz Wetzlab, German). Dichos cortes se teñirán con hematoxilina-eosina.

Metodología común a todos los objetivos:

Estudios histopatológicos: será realizado por la anatomopatóloga del equipo sobre los preparados de las tibias en la zona del disco epifisiario de crecimiento y del hueso esponjoso primario de la tibia proximal. Respecto al cartílago, se evaluará la morfología de las células del cartílago y las zonas hiperplásica e hipertrófica del disco epifisiario. En el hueso subcondral,  se analizará la disposición, conectividad trabecular, relación con el tejido hematopoyético y celularidad del tejido óseo. Este análisis se llevará a cabo a una distancia de hasta 1 mm distal al borde inferior del disco epifisiario.

Estudios histomorfométricos:
Para la realización de las medidas histomorfométricas se efectuarán fotografías de los preparados histológicos de las tibias con una cámara digital (Olympus) adaptada a un microscopio (Olympus, Zeizz). Se determinarán parámetros histomorfométricos estáticos a nivel del hueso esponjoso primario de la tibia proximal: volumen de tejido total (TV), volumen óseo trabecular (BV), superficie ósea trabecular (BS). Con estos valores, se calcularán el porcentaje de volumen de hueso trabecular (%BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th), número de trabéculas (Tb.N) y separación de las trabéculas (Tb.Sp). También se determinará la superficie cubierta por: osteoblastos activos (Ob.S/BS), osteoclastos (Oc.S/BS) y células de revestimiento (Lc.S/BS). Las medidas se llevarán a cabo a una distancia de hasta 1mm distal al borde inferior del disco epifisiario y en un área de 2 mm2 sobre las imágenes digitalizadas. A nivel del disco epifisiario de crecimiento se medirán el espesor de la  zona hiperplásica, el espesor de la zona hipertrófica y el espesor total del disco epifisiario.
Todas las mediciones se realizarán con el programa Image J 1.40 (Nacional Institutes of Health, Maryland, USA).

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14. Evaluación de la estructura y resistencia del hueso trabecular en ratas tratadas con monofluorofosfato de sodio y actividad física

Integrantes: Cielo Maher, Lic. Mercedes Lombarte, Lic. Brenda Fina, Dr. Alfredo Rigalli

Beca Consejo Interunivesitario Argentina 2014

Introducción

La pérdida de masa ósea es un problema de salud pública. Las drogas utilizadas para evitar esta pérdida modifican la remodelación ósea, proceso por el cual el hueso mantiene su estructura y funciones. Los tratamientos utilizados se encuentran en etapa de desarrollo, sus mecanismos son motivo de estudio y están orientados a modificar la resorción o formación por separado. La recomendación de la realización de actividad física es una constante, pero son pocos los trabajos que evalúan la acción conjunta del ejercicio físico y la farmacología.
El fluoruro es un mitógeno de las células óseas que produce incremento de la masa ósea. Las drogas más utilizadas como fuente de fluoruro en terapéutica humana son el fluoruro de sodio (NaF) y monofluorofosfato (MFP). Las farmacocinéticas del MFP y el NaF son diferentes, teniendo el MFP un mayor efecto sobre el tejido óseo.
La esclerostina es un inhibidor del sistema involucrado en la diferenciación de osteoblastos. La carga mecánica sobre osteoblastos en cultivo ha demostrado inhibir su expresión y por lo tanto incrementar la diferenciación celular . La carga mecánica sobre la tibia de ratones mostró un descenso en la expresión de esclerostina en la tibia proximal de ratones, donde se utilizó un instrumento de acción mecánica longitudinal en ciclos regulares. Con respecto a la actividad física, se conoce en este momento parte del mecanismo involucrado en la estimulación de la formación ósea, debido a la disminución de la producción de esclerostina por los osteocitos. Además, existen trabajos donde se demuestra que el ejercicio físico puede ser útil para incrementar la masa ósea en ratas jóvenes y adultas, a expensas de un aumento en la formación y un descenso en la resorción. A su vez, este efecto es más significativo cuando la actividad física se sostiene durante toda la vida. Se han desarrollado modelos para su estudio pero no existe información de estudios combinados con el MFP. Además, se ha demostrado que el ejercicio físico posee respuestas osteogénicas en el desarrollo de los huesos y modifica los efectos adversos sistémicos inducidos por el fluoruro.
La ovariectomía (OVX) en ratas es el modelo animal de pérdida de masa ósea postmenopáusica más utilizado, siendo las características de dicha pérdida comparables a los de la mujer postmenopáusica.

Objetivos

Está demostrado que el tratamiento con MFP y la actividad física tienen efecto beneficioso sobre el desarrollo, crecimiento y mantenimiento de la masa ósea. El mecanismo de acción del MFP y la actividad física permiten formular la hipótesis que la aplicación de ambos tratamientos podría tener un efecto sinérgico.

Objetivo general: Evaluar la resistencia y la estructura del hueso trabecular en ratas tratadas con monofluorofosfato de sodio y ejercicio físico

Objetivos específicos:

1- Evaluar la resistencia ósea en un ensayo de compresión del hueso trabecular diafisario de fémur de rata.
2- Evaluar los parámetros histomorfométricos óseos del hueso trabecular en la diáfisis femoral.
3- Evaluar la conectividad de las trabéculas del hueso esponjoso en la díafisis femoral.

Metodologia

Con el fin de hacer una presentación ordenada de la metodología, en primer lugar se hace una descripción general del experimento y al final de esta sección se detallan las técnicas utilizadas.
Con el fin de alcanzar los objetivos específicos planteados, se utilizarán ratas Sprague Dawley con osteoporosis inducida por ovariectomía bilateral, de 50 días de edad. Luego de 30 días de realizada la ovariectomía y establecida la pérdida de masa ósea. Las ratas serán tratadas con monofluorofosfato de sodio (MFP) por sonda orogástrica durante 30 días. Además las ratas realizarán actividad física en cinta ergométrica durante 45 minutos diarios. Al finalizar el tratamiento y luego de la eutanasia se obtendrán los fémures sobre los que se realizarán estudios que se indican por separado a continuación en cada objetivo. Simultáneamente se constituirán grupos de ratas controles: con cirugía de ovariectomía simulada y sin actividad física, con ovariectomía y ejercicio y con ovariectomía y actividad física. Cada grupo tendrá en la primera repetición del experimento 5 animales. Está planeado repetir 3 veces el experimento.

Objetivo 1- Evaluar la resistencia ósea a través de un ensayo de compresión del hueso trabecular diafisario de fémur. La resistencia del hueso trabecular se evaluará por un ensayo biomecánico de compresión sobre una sección transversal de la diáfisis distal del fémur derecho.

Objetivo 2- Evaluar los parámetros histomorfométricos óseos del hueso trabecular en la diáfisis femoral. Los parámetros histomorfométricos óseos se medirán en un corte histológico del hueso trabecular en la diáfisis femoral izquierda en sitio homólogo al que se realizó el ensayo biomecánico descripto en objetivo 1.

Objetivo 3- evaluar la conectividad de las trabéculas del hueso esponjoso en la diáfisis femoral

La conectividad trabecular se evaluará en el mismo corte histológico mencionado en el objetivo 2.

Osteoporosis inducida por ovariectomía: la ablación de los ovarios se realizará bajo anestesia con ketamina y xilazina (De Candia 2009). Antes de la cirugía recibirán 6 mg de ceftriaxona por vía intramuscular como antibioticoterapia. Durante la recuperación del animal se realizará hidratación por vía rectal con solución fisiológica. A continuación se alojarán en jaulas individuales y recibirán antibioticoterapia y analgesia (Landoni 2009). El éxito de la cirugía se evaluará al finalizar el tratamiento por comparación del peso del útero con respecto a los valores del peso del útero de ratas normales de la misma edad.

Administración de MFP: se administrará diariamente por sonda orogástrica en una solución acuosa. La dosis prevista es 40 umol/100 g de peso corporal.

Actividad física dosificada con cinta ergométrica: la actividad física será dosificado a través deuna cinta ergométrica para animales, con un período de acostumbramiento incrementando 5 minutos por día hasta alcanzar el tiempo establecido. La intensidad de la actividad física será establecida en 25 o 50% de la VO2max.

Histomorfometría ósea estática: Se realizará sobre cortes histológicos descalcificados de las epífisis distales del fémur izquierdo. Se obtendrán imágenes digitales y utilizando un software de análisis de imágenes se medirán parámetros estáticos: volumen óseo, número, espesor y separación trabecular, superficie cubierta por osteoblastos y por osteoclastos (Parfit 1987).

Evaluación biomecánica de los huesos: Las propiedades biomecánicas se medirán inmediatamente. Se utilizará un equipo con una velocidad de avance del punto central de 10 µm/seg. Los valores de la fuerza serán determinados con una celda de carga de 2mV/V y los datos de fuerza y desplazamiento serán capturados por un software específico. Este software arroja medidas de la fuerza en función del desplazamiento, fuerza de fractura y rigidez, a través de cálculos que involucran el momento de inercia de sección transversal se calculará el estrés y módulo de Young.

Conectividad trabecular: para esta determinación se procederá a la esqueletonización de las trabéculas óseas (Harrar 2012) y a cuantificar los siguientes parámetros: Nd = número total de nodos, NNd = número de trabéculas que conectan dos nodo, NNdTm = número de trabéculas que conectan un nodo con un trabécula que tiene una extremidad libre terminal, Tm (terminal): número de extremidades libres de las trabéculas, T (tree) hace referencia la estructura compuesta de nodos interconectados con nodo-nodo y/o ramas nodo terminal, Longitud de cada rama. Con dichos valores se procede a calcular el Índice de conectividad (ICI), la Relación nodo-nodo / terminal (R = Nd / Tm). Esta relación proporciona información acerca de la tasa de nodos relativos al número de extremidades libres de las trabeculas A mayor valor de este parámetro, mayor conectividad del hueso trabecular. Número de trabéculas cuyos extremos son terminales (NTm): Este parámetro proporciona información acerca de la pérdida de la conectividad en la arquitectura ósea, longitud de trabéculas: El parámetro Dist da una idea de la longitud promedio de cada trabéculas que conecta dos nodos o un nodo con un terminal. A mayor Dist, mayor rigidez (parámetro biomecánico) y NDX INDEX: Combina parámetros de conectividad e histomorfométricos como lo son el volumen óseo trabecular (BV/TV), el espesor trabecular (TbTh) y la separación trabecular (TBSp). falta fórmula

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15. Desarrollo de un equipamiento para ensayos biomecánicos ósea destinado a estudios de investigación básico sobre estructura ósea

Integrantes: Franco Romano, Renzo Morzán, Nicolás Dri, Nicolás Rigalli, Dr. Lucas Brun, Dr. Alfredo Rigalli

Subsidio de Vinculación Tecnológica

Introducción

La osteoporosis es una enfermedad originada por pérdida de la masa ósea. La osteoporosis postmenopáusica es la forma más común y afecta a 1 de cada 4 mujeres mayores de 50 años. El desarrollo de drogas con el fin de detener la pérdida de masa ósea es incesante y dicho desarrollo requiere la evaluación de su efectividad en animales. Dado que el hueso tiene como principales funciones el sostén y la protección, su función depende de su resistencia. Aunque existen diversas variables que se pueden estudiar y están relacionadas a la resistencia ósea, la confirmación si una droga tiene el efecto deseado sobre el tejido óseo se evalúa en último término por su capacidad de resistir a la fractura mejor que cuando no se aplica dicho tratamiento. Estos ensayos se realizan utilizando equipamientos que tienen la posibilidad de medir la deformación del hueso estudiado y la fuerza a la que se fractura el mismo. Existe una decena de empresas extranjeras que producen estos equipos, pero los costos son en la mayoría de los casos inaccesibles para laboratorios que funcionan en el ámbito estatal

Objetivos

General: Desarrollar un equipamiento para medida de la resistencia de huesos de animales de experimentación sometidos a estudios de acción de drogas con acción beneficiosa o negativa sobre la estructura ósea

Específicos
1- Automatizar un prototipo manual para estudios de resistencia ósea.
2- Desarrollar el software que permita adquirir los datos del ensayo y controlar automáticamente el equipo.

Metodología

El ensayo de drogas en animales de experimentación con fines de aumentar o mantener la masa ósea es habitual e independientemente de las variables investigadas, la medida de resistencia ósea es la confirmación del éxito del tratamiento. En animales este estudio se realiza luego de la eutanasia del animal y el el único estudio que demuestra si la droga fue o no efectiva, ya que la principal función ósea es la de sostén.
Los ensayos biomecánicos se realizan con instrumentos importados cuyos costos sin accesorios superan los u$s 30000, existiendo una gran variedad de modelos. Estos equipos son básicamente sencillos y posibles de contruir en la Argentina. En el Laboratorio de Biología Ósea ya se ha desarrollado un prototipo del mismo que cuenta con una unidad de prueba mecánica, una unidad digitalizadora de datos y un software que registra e interpreta los datos (Biomedical Data Acquisition suite 1.0) ya tiene registro de propiedad intelectual.
El objetivo de este proyecto es automatizar el equipo a través de motores que permitan un funcionamiento más regular y desarrollar la versión 2.0 del software que además de la adquisición de datos controle el equipamiento. También es objetivo de este proyecto registrar el modelo fabricado.

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16. Evaluación del contenido de hidratos de carbono, calcio y fosfato de bebidas no alcohólicas de distribución en la República Argentina y el consumo a nivel poblacional

Integrantes: Dra. Marta Posadas, Dra. María Olguín, Dra. Fabiana Garcia, Lic. Mercedes Lombarte, Sra. Hilda Moreno.

Proyecto Subsidiado por Fundación Alberto J. Roemmers

Introducción

Desde los años 80 el jarabe de maíz de alta fructosa (JMAF) ha ido reemplazando a otros edulcorantes nutritivos y representa en la actualidad más de un 40% de la totalidad del consumo de éstos a nivel mundial. Una de las razones para el uso del JMAF radica en el mayor poder edulcorante y la sencillez en la manipulación.
Numerosos trabajos han descripto una relación entre el incremento en la prevalencia de obesidad y sus comorbilidades con el consumo de alimentos ricos en azúcares, en particular fructosa, mayormente en la forma de JMAF. Entre los efectos perjudiciales de la fructosa sobre la salud se han reportado: sobrepeso, obesidad, resistencia insulínica, diabetes tipo 2, dislipidemias, hiperuricemia e hígado graso no alcohólico.
Algunos estudios han relacionado el alto consumo de fructosa con la instalación de desórdenes similares a los generados por el excesivo consumo de alcohol y algunos trabajos loa responsabilizan de enfermedades crónicas causantes de la mayor proporción de muertes en los países desarrollados.
En contraposición, existe también un importante número de trabajos publicados, entre ellos varios meta-análisis, en los que se concluye que los efectos del consumo elevado de la fructosa no son diferentes de los que se derivarían de una ingesta del mismo nivel de otros azúcares, tales como sacarosa y glucosa. El efecto sobre el tejido óseo es contradictorio. En ratas la dieta con fructosa produjo más hueso, con menor grosor trabecular y mayor resistencia ósea. Se ha demostrado que la fructosa disminuye la expresión de proteínas involucradas en el transporte y absorción de calcio. Se ha reportado también que el consumo de bebidas gaseosas conduce a la disminución del consumo de leche en niños con sus posibles consecuencias sobre la masa ósea.
El debate sobre si el consumo de JMAF podría tener un importante papel en la creciente epidemia de obesidad de los Estados Unidos de Norteamérica y otros países se instaló en 2004 y continúa con vehemencia.
La fructosa fue recomendada durante un largo tiempo como "azúcar para los diabéticos" teniendo en cuenta el muy bajo índice glucémico. Sin embargo, al ir profundizando en el conocimiento del metabolismo de la fructosa esta supuesta “ventaja” fue perdiendo sustento. Del total de la fructosa absorbida a nivel intestinal un alto porcentaje es rápidamente derivado al hígado, donde se metaboliza para dar origen a glucosa -en más de un 50% de lo ingerido- lactato y ácidos grasos.
Si bien la cantidad de líquidos así como el patrón de bebidas consumidas tiene profundas implicancias en la salud, en Argentina la información epidemiológica al respecto es escasa. Entre los pocos estudios llevados a cabo, se destaca uno de reciente ejecución –el estudio HidratAr- cuyo hallazgo más importante fue que la ingesta media en nuestro país está compuesta por 21 % de agua, 29 % de bebidas con sabor sin calorías y 50 % de bebidas azucaradas. Este consumo de azúcar oculto se puede asociar con una mayor ingesta energética -no está regulado por los mismos mecanismos de saciedad de los alimentos sólidos- condicionando un mayor riesgo metabólico.

Objetivos

1- Evaluar el contenido y la clase de hidratos de carbono presentes en bebidas no alcohólicas de distribución en la República Argentina.
2- Evaluar el consumo de dichas bebidas en la población.

Metodología

Se realizará la determinación de glucosa, fructosa y sacarosa en bebidas analcohólicas de distribución en la Republica Argentina. La recolección de las muestras estará a cargo de alumnos de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario. El grupo de trabajo de este proyecto tiene experiencia en este tipo de estudios, permitiendo además de un muestreo más amplio, un menor gasto para el proyecto.
Los alumnos serán enrolados de manera voluntaria por invitación a través de los medios de difusión que consultan habitualmente (Facebook y/o páginas web de los laboratorios involucrados, invitaciones personales). Se realizará una reunión informativa con los estudiantes interesados a quienes se les entregarán tubos de polietileno con tapa para la recolección de 10 ml de cada una de las bebidas que consumen en sus hogares. El trabajo no demandará gastos extra para los alumnos y dado que los alumnos provienen de localidades de diferentes provincias se podrá contar con bebidas que aunque sean de la misma marca provengan de embotelladoras diferentes. Este procedimiento de muestreo garantizará una mayor hetoregeneidad en las muestras. Las muestras a estudiar serán guardadas en freezer a -20ºC hasta su procesamiento.Se realizará la determinación de glucosa, fructosa y sacarosa en bebidas analcohólicas de distribución en la Republica Argentina. La recolección de las muestras estará a cargo de alumnos de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario. El grupo de trabajo de este proyecto tiene experiencia en este tipo de estudios, permitiendo además de un muestreo más amplio, un menor gasto para el proyecto.
Los alumnos serán enrolados de manera voluntaria por invitación a través de los medios de difusión que consultan habitualmente (Facebook y/o páginas web de los laboratorios involucrados, invitaciones personales). Se realizará una reunión informativa con los estudiantes interesados a quienes se les entregarán tubos de polietileno con tapa para la recolección de 10 ml de cada una de las bebidas que consumen en sus hogares. El trabajo no demandará gastos extra para los alumnos y dado que los alumnos provienen de localidades de diferentes provincias se podrá contar con bebidas que aunque sean de la misma marca provengan de embotelladoras diferentes. Este procedimiento de muestreo garantizará una mayor hetoregeneidad en las muestras. Las muestras a estudiar serán guardadas en freezer a -20ºC hasta su procesamiento.
En la reunión mencionada los alumnos recibirán una planilla de manera que registren de manera anónima cada persona de su entorno familiar que consuma dichas bebidas, indicando marca, cantidad aproximada de consumo diario o semanal.
Sobre las muestras se determinará sacarosa, fructosa y glucosa. La glucosa se determinará utilizando glucosa oxidasa en presencia de un cromóforo que se lee espectrofotométricamente a 505 nm. La sacarosa se determinará a través del contenido de glucosa de la muestra posterior a la hidrólisis en medio ácido a 100 ºC durante 15 minutos, restando el contenido de glucosa medido antes de la hidrólisis. La fructosa se medirá por la reacción de Seliwanoff con resorcinol en medio ácido. En las muestras se determinará el contenido de fosfato por colorimetría a 690 nm por reacción con molibdato de amonio y reducción con cloruro estañoso y el calcio se medirá por absorción atómica.

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